多重耐藥及泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵基因adeB的研究

孫靜娜，劉青松，劉澤世，趙 帥，王國(guó)欣，張 征*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050031；2.河北省容城縣醫(yī)院普外科，河北 容城 071700）

多重耐藥及泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵基因adeB的研究

孫靜娜1，劉青松2，劉澤世1，趙 帥1，王國(guó)欣1，張 征1*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050031；2.河北省容城縣醫(yī)院普外科，河北 容城 071700）

目的 觀察多重耐藥及泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌主動(dòng)外排泵在耐藥方面的作用和外排泵基因表達(dá)情況。方法 通過比較加入羰基氰氯苯（carbonyl cyanldem-chlorophenyl hydrazone，CCCP）泵抑制劑前后，96株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)四環(huán)素、諾氟沙星、慶大霉素、頭孢噻肟4種藥物最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的變化，篩選出34株外排泵表型陽性的鮑曼不動(dòng)桿菌。用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增對(duì)34株菌進(jìn)行外排泵蛋白基因adeB的檢測(cè)和分析，并測(cè)序。結(jié)果 最終篩選出對(duì)4種抗生素MIC值均降低4倍及以上菌34株（35.42%），34株外排泵表型陽性的鮑曼不動(dòng)桿菌檢測(cè)到adeB基因33株，檢出陽性率為97.06%。對(duì)33株鮑曼不動(dòng)桿菌的外排泵基因adeB進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)比對(duì)所測(cè)序列與基因庫（Genebank）中序列同源性為100.00%。結(jié)論 泵抑制劑CCCP對(duì)于逆轉(zhuǎn)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)四環(huán)素、諾氟沙星、慶大霉素、頭孢噻肟4種抗菌藥物的耐藥性起到重要作用，主動(dòng)外排泵基因是鮑曼不動(dòng)桿菌發(fā)生多重耐藥的重要因素。

鮑氏不動(dòng)桿菌；抗藥性，多藥；基因表達(dá)

鮑曼不動(dòng)桿菌在住院患者尤其是有免疫缺陷或重癥監(jiān)護(hù)病房患者尤為常見，75%住院患者可定植鮑曼不動(dòng)桿菌，在醫(yī)院內(nèi)則很容易通過交叉感染暴發(fā)流行［1］。耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌呈世界性流行，也已成為我國(guó)院內(nèi)感染最重要的病原菌之一［2］。尤其是多重耐藥及泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在住院患者體內(nèi)的出現(xiàn)，與不合理使用抗菌藥物增加細(xì)菌產(chǎn)生耐藥有關(guān)［3］。其中，多藥外排系統(tǒng)是鮑曼不動(dòng)桿菌多藥耐藥的一個(gè)重要原因。特別是AdeABC外排泵參與了鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨基糖甙類藥物、β-內(nèi)酰胺類藥物、氯霉素、紅霉素和四環(huán)素的耐藥。本研究對(duì)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵系統(tǒng)進(jìn)行基因檢測(cè)并測(cè)序，探討鮑曼不動(dòng)桿菌主動(dòng)外排泵系統(tǒng)在耐藥方面的作用，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源：本實(shí)驗(yàn)所用菌株來自 2012—2013

年河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院72株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌及24株泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌。取純培養(yǎng)細(xì)菌增菌液lmL與0.5mL 50%甘油肉湯混勻，－70℃冰箱保存并備用。

1.2 儀器：Maxwell-16核酸提取儀（美國(guó)Promega

公司），Mini-4K／6K微型離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司），AB 9700PCR擴(kuò)增儀（美國(guó) AB公司），DYY-12電泳儀（北京六一儀器廠），VilBer LouRMAT凝膠成像系統(tǒng) （法國(guó) VILBER LOURMAT公司），SIGMA 3-18K臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）。

1.3 試劑：羰基氰氯苯腙（carbonyl cyanldemchlorophenyl hydrazone，CCCP）泵抑制劑，泵抑制劑溶解試劑二甲亞砜購于河北博世林公司；抗菌藥物四環(huán)素、諾氟沙星、慶大霉素、頭孢噻肟均購于英國(guó)OXID公司；引物adeB由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；DNA提取試劑盒Maxwell?16 Cell LEV DNA Purification Kit購自 Promega公司；聚合酶鏈反應(yīng) （polymerase chain reaction，

PCR）擴(kuò)增試劑 GoTaq?Green Master Mix和

GoTaq?Colorless Master Mix購自美國(guó) Promega公司；DNA染色劑 Goldview和 DNA Ladder Marker購自北京賽百盛公司；瓊脂糖X-gal購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 加入外排泵抑制劑前后抗菌藥物最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）：采用微量肉湯稀釋法測(cè)定加入工作濃度的泵抑制劑CCCP前后，4種抗菌藥物四環(huán)素、慶大霉素、諾氟沙星、頭孢噻肟對(duì)96株鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC，同時(shí)加入泵抑制劑和空白孔作為生長(zhǎng)對(duì)照。

1.4.2 外排泵表型陽性鮑曼不動(dòng)桿菌的判定：參考Sylvia Valdezate方法，比較應(yīng)用CCCP泵抑制劑前后96株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物 MIC值的變化，以加入泵抑制劑后MIC值較不加泵抑制劑降低4倍或以上作為外排泵表型陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.3 外排泵蛋白基因adeB：采用PCR技術(shù)檢測(cè)外排泵蛋白基因adeB。

1.4.3.1 adeB基因PCR引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)基因庫（GenBanK）中已發(fā)布的各型基因序列和參考文獻(xiàn)［4］自行設(shè)計(jì)基因引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約 541bp，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物A，5′-TTAACGATAGCGTTGTAACC-3′（AF-370885）；引物B，5′-TGAGCAGACAATGGAATAGT-3′（AF370885）。

1.4.3.2 電泳：緩沖液0.5×TBE（電泳液配制10× TBE，108gTris堿、7.44g Na2EDTA·2H2O和55g硼酸，加超純水至 1L，使用時(shí)用水稀釋為0.5× TBE），電壓100V，上樣標(biāo)本量8μL，DNA相對(duì)分子質(zhì)量Maker（100bp）8μL，電泳50min；置于全自動(dòng)凝膠圖像成像儀上觀察結(jié)果并照相，出現(xiàn)與目的基因片段分子相當(dāng)?shù)臈l帶判為陽性。

1.4.4 adeB基因測(cè)序：把陽性DNA條帶所在的凝膠切下，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和切下的含陽性DNA的凝膠送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。用DNA Star軟件中的Editseq和Megalign分析測(cè)得的核苷酸序列，取雙向測(cè)序結(jié)果一致的序列作為參比序列，應(yīng)用NCBI中BLAST程序比對(duì)序列。

2 結(jié) 果

2.1 4種抗菌藥加入CCCP泵抑制劑前后MIC變化情況：在加入CCCP泵抑制劑前后，96株多重耐藥株對(duì)四環(huán)素、諾氟沙星、慶大霉素、頭孢噻肟的MIC范圍分別由32～128、64～128、16～128、64～128mg／L變?yōu)?～64、1～128、1～64、8～128mg／L。 見表1。

表1 4種抗菌藥加入CCCP抑制劑前后MIC變化結(jié)果Table 1 The influence four antimicrobials of on MIC scope before and after pump inhibitors （mg／L）

2.2 篩選出外排泵表型陽性菌情況：96株多重耐藥和泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌株篩選出外排泵表型陽性菌34株。在加入泵抑制劑CCCP后四環(huán)素的藥敏結(jié)果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型陽性者37株，降低2倍者 8株，沒有變化者 51株；諾氟沙星的藥敏結(jié)果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型陽性者41株，降低 2倍者 12株，沒有變化者 43株；慶大霉素的藥敏結(jié)果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型陽性者 53株，降低2倍者9株，沒有變化者34株；頭孢噻肟的藥敏結(jié)果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型陽性者 39株，降低2倍者 6株，沒有變化者51株。其中，篩選出34株鮑曼不動(dòng)桿菌在加入CCCP泵抑制劑后4種抗生素MIC值均降低4倍。見表2。

表2 多重耐藥菌和泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵表型Table 2 The efflux phenotype positive of multidrug resistant and pandrug resistantAcinetobacter baumannii （n ）

2.3 adeB基因的檢出情況：34株鮑曼不動(dòng)桿菌檢測(cè)到adeB基因的有33株，檢出率為97.06%。adeB基因擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖1。

圖1 adeB基因擴(kuò)增電泳結(jié)果M：DNA相對(duì)分子質(zhì)量（100、250、500、750、1 000、2 000 bp）Figure 1 Electrophoresis of PCR product of adeB geneM：DNA marker（100，250，500，750，1 000，2 000 bp）

2.4 adeB基因測(cè)序結(jié)果：取正反向雙向測(cè)序結(jié)果一致的序列作為參比序列，應(yīng)用NCBI中BLAST程序比對(duì)序列，經(jīng)比對(duì)所測(cè)序列與 Genebank中序列同源性均為100.00%，未發(fā)現(xiàn)基因變異現(xiàn)象。adeB基因測(cè)序結(jié)果見圖2。

圖2 adeB基因測(cè)序結(jié)果Figure 2 The sequence of the adeB genes

3 討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌是引起院內(nèi)感染的最為重要的機(jī)會(huì)致病菌。鮑曼不動(dòng)桿菌通過其酶機(jī)制、外排泵、抗?jié)B性等極容易形成耐藥菌株。其中外排機(jī)制是將抗菌藥物及其復(fù)合物由生物膜內(nèi)排至體外環(huán)境，其在細(xì)菌耐藥，尤其是多重耐藥中發(fā)揮重要作用［5］。主動(dòng)外排泵是由菌體細(xì)胞膜表面蛋白組成的，可以將進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的藥物排出到細(xì)胞外，外排泵的過度表達(dá)都可以引起鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥迅速增加［6］。AdeABC外排泵系統(tǒng)是引起鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥的重要因素。主動(dòng)外排泵的過度表達(dá)引起介導(dǎo)了部分菌株對(duì)美羅培南的耐藥，而亞胺培南的耐藥性可能與外排泵機(jī)制無關(guān)［7］。多藥及毒性化合物外排家族的過度表達(dá)引起喹諾酮類、慶大霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素敏感性的降低［8］。

本實(shí)驗(yàn)選取了四環(huán)素、諾氟沙星、慶大霉素、頭孢噻肟4種抗菌藥物作為外排底物；選取了CCCP泵抑制劑為篩選條件，CCCP分子在解離狀態(tài)下，可以在磷脂膜兩側(cè)自由擴(kuò)散，而質(zhì)子的傳遞破壞跨膜電化學(xué)梯度，因此CCCP是一種很強(qiáng)的解偶聯(lián)劑，可以阻斷菌體表面蛋白能量的供應(yīng)，使外排泵無法正常工作，藥物不被外排而蓄積于菌體內(nèi)，從而提高鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)藥物的敏感性。本研究結(jié)果表明，四環(huán)素、諾氟沙星、慶大霉素、頭孢噻肟加入CCCP泵抑制劑前后 MIC范圍分別由 32～128、64～128、16～128、64～128mg／L變?yōu)?～64、1～128、1～64、8～128mg／L；四環(huán)素的藥敏結(jié)果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型陽性者 37株，降低 2倍者 8株，沒有變化者51株；諾氟沙星的藥敏結(jié)果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型陽性者41株，降低2倍者12株，沒有變化者43株；慶大霉素的藥敏結(jié)果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型陽性者 53株，降低2倍者9株，沒有變化者34株；頭孢噻肟的藥敏結(jié)果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型陽性的共有 39株，降低 2倍者 6株，沒有變化者 51株。其中，篩選出34株鮑曼不動(dòng)桿菌在加入CCCP泵抑制劑后4種抗生素MIC值均降低4倍。篩選出34例可能由于外排泵的存在而產(chǎn)生耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌，說明CCCP外排泵抑制劑對(duì)逆轉(zhuǎn)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥行之有效。

本研究進(jìn)一步對(duì)34株外排泵表型陽性的鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行AdeABC外排泵的跨膜組件AdeB基因測(cè)定，檢測(cè)到 adeB基因 33株，檢出陽性率為97.06%。取正反向雙向測(cè)序結(jié)果一致的序列作為參比序列，應(yīng)用NCBI中BLAST程序比對(duì)序列，經(jīng)比對(duì)所測(cè)序列與 Genebank中序列同源性均為100.00%，未發(fā)現(xiàn)基因變異現(xiàn)象。表明AdeABC外排泵機(jī)制在鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物敏感性方面的作用尤其重要，含有adeB基底泵的重組衍生體相對(duì)于不含有的菌株抗菌素的敏感性降低。與王同慧等［9］認(rèn)為外排泵機(jī)制在鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥中具有重要作用結(jié)論一致。此外，結(jié)構(gòu)基因的失活尤其是編碼轉(zhuǎn)錄蛋白的adeB，外排泵活性的增強(qiáng)以及不同的外排泵之間相互作用仍有待研究。

本研究為使用抗生素作用于多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的靶位提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為臨床提高抗生素使用效率和研制開發(fā)新的抗菌藥物提供了理論依據(jù)。

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（本文編輯：趙麗潔）

RESEARCH ABOUT EFFLUX PUMP GENE adeB IN MULTIDRUG RESISTANCE AND PANDRUG RESISTANTACINETOBACTER BAUMANNII

SUN Jingna1，LIU Qingsong2，LIU Zeshi1，ZHAO Shuai1，WANG Guoxin1，ZHANG Zheng1*
（1.Clinical Laboratory，the First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang050031，China；2.Department of General Surgery，the Hospital of Rongcheng County，Hebei Province，Rongcheng071700，China）

ObjectiveTo investigate efflux pump drug-resistance and gene expression in multidrug resistant and pandrug resistantAcinetobacter baumannii.MethodsThe multidrug resistantAcinetobacter baumanniiefflux pump phenotypes were detected by joining carbonyl cyanidem-chloropheny hydrazone（CCCP）pump inhibitors，the minimum inhibitory concentration（MIC）variation was observed in 96 strains ofAcinetobacter baumanniiresistant to tetracycline，norfloxacin，gentamicin，cefotaxime，34 strainsofefflux phenotypepositiveAcinetobacter baumanniiwere screened out.The efflux pump protein gene adeB in 34Acinetobacter baumanniiwere detected and sequenced with the polymerase chain reaction amplification.ResultsThe initial selection involoed 34 strains（35.42%）whose MIC reduced by 4 times and above.In 34 stains of efflux pump phenotype positiveAcinetobacter baumannii，33 strains were detected adeB gene，the positive rate was 97.06%.When the 33 strainsAacinetobacter baumanniiadeB efflux pump gene were sequenced，the sequence homology was 100.00%compared in Genebank.ConclusionPump inhibitor CCCP plays an important role in the reversal ofAcinetobacter baumanniiresistant totetracycline，norfloxacin，gentamicin and cefotaxime，active efflux pump genes play an important role in multidrug resistantAcinetobacter baumannii.

acinetobacter baumannii；drug resistance，multiple；gene expression

R378.79

A

1007-3205（2014）10-1166-04

2014－04－25；

2014－06－12

孫靜娜（1976－），女，河北保定人，河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院副主任檢驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事微生物學(xué)檢驗(yàn)研究。

*通訊作者。E-mail：zhangzheng197101＠163.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.016