人卵巢顆粒細胞FoxO基因和卵泡刺激素受體基因的表達及相關性研究

梁 瑩，米梅艷，李淑賢，周 莉，吳曉茜，雷靈梅

（1.河北省石家莊市第四醫院生殖中心，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第四醫院婦科，河北 石家莊050011；3.河北省石家莊市第四醫院檢驗科，河北 石家莊050011）

人卵巢顆粒細胞FoxO基因和卵泡刺激素受體基因的表達及相關性研究

梁 瑩1，米梅艷2*，李淑賢2，周 莉1，吳曉茜1，雷靈梅3

（1.河北省石家莊市第四醫院生殖中心，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第四醫院婦科，河北 石家莊050011；3.河北省石家莊市第四醫院檢驗科，河北 石家莊050011）

目的 研究人卵巢顆粒細胞叉頭框（forkhead box，Fox）基因和卵泡刺激素受體（follicle stimulating hormone receptor，FSHR）的表達及相關性。方法 接受體外受精－胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）不孕癥患者126例，按照妊娠結果分為妊娠組63例，未妊娠組63例。回顧性分析取卵日成熟卵泡壁顆粒細胞FoxO1、FoxO3a和 FSHR mRNA的表達，并對 FoxO1、FoxO3a、FSHR之間及與血清促黃體生成素（luteotropic hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2）、孕酮（progesterone，P）進行相關性分析。結果 妊娠組血清 E2水平高于未妊娠組（P＜0.01）；妊娠組優質胚胎數多于未妊娠組（P＜0.01）；2組LH、P、獲卵數差異無統計學意義（P＞0.05）。妊娠組FoxO1 mRNA表達高于未妊娠組（P＜0.01）；2組FoxO3a及FSHR mRNA差異無統計學意義（P＞0.05）。FoxO1和FoxO3a與FSHR的相關性系數分別為0.881、0.999（P＜0.01i）。結論 FoxO1和FoxO3a參與卵母細胞質量的調節，其功能與FSHR有密切關系。

卵泡刺激素，人；卵丘細胞；卵母細胞

人卵母細胞位于卵泡內，由顆粒細胞包圍，與顆粒細胞之間有相互的對話和作用。卵母細胞能夠誘導顆粒細胞增殖與分化，而顆粒細胞對卵母細胞有營養支持的作用。因此，顆粒細胞增殖、分化與凋亡能夠影響卵母細胞質量。有文獻［1］報道，接受體外受精－胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）治療患者的壁層顆粒細胞和卵丘細胞凋亡率低與其卵母細胞的發育和受精能力呈正相關。Forkhead（Fox）轉錄因子在 2000年發布統一命名，因它們在生物體內的重要作用，成為科學研究的熱點［2－3］。FoxO是通過轉錄和信號轉導途徑在動物的組織代謝、發育以及細胞的周期調控等方面有重要作用［2，4－5］，它們是胰島素／胰島素樣生長因子（insulin／insulin-like growth factor 1，INS／IGF-1）信號通路中關鍵因子之一。研究［6－7］表明，FoxO1、FoxO3a在細胞的增殖和凋亡過程中起著重要的作用。因而本研究選取FoxO1、FoxO3a以及卵泡刺激素受體（follicle stimulating hormone receptor，FSHR）基因，研究其在顆粒細胞上的表達及它們之間的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2010年9月—2011年7月在河北省石家莊市婦產醫院生殖醫學中心接受IVFET治療的不孕癥患者126例，診斷標準參考《婦產科學》第7版［8］。按照妊娠結局分為妊娠組和未妊娠組。其中妊娠組 63例，年齡 23～39歲，平均（29.36±4.03）歲；未妊娠組 63例，年齡24～39歲，平均（29.40±3.19）歲。2組一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。該研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 納入及排除標準：納入標準符合西醫診斷標準。①年齡＜40歲；②基礎卵泡刺激素＜10U／L；③簽署知情同意書。排除標準為子宮內膜異位癥；子宮不具備妊娠功能或嚴重軀體疾病不能承受妊娠；泌尿生殖系統感染；性傳播疾病；患有嚴重的精神疾患；有吸毒等嚴重不良嗜好；接觸致畸量的射線和毒物并處于作用期。

1.3 治療方法：所有患者采用常規長方案促排卵治療，月經的第21天或黃體中期開始皮下注射醋酸曲普瑞林（Triptorelin Acetate，0.1mg／支，法國博福－益普生，D22863）0.1mg／d，至少 14d。達到降調節標準后，即子宮內膜≤5mm，血清雌二醇（estradiol，E2）＜50ng／L后，每日注射重組人促卵泡激素（Gonal-F，果 那 芬，75U／支，默 克 雪 蘭 諾，AU002290）250～300U／d，觀察血清促黃體生成素（luteotropic hormone， LH ）、 E2、 孕 酮（progesterone，P）及 B超監測卵泡發育情況，當60%卵泡的直徑≥18mm時停藥，給予重組絨促性素250g（艾澤，250g／支，默克雪蘭諾，DA009256）誘導卵泡成熟，36～38h經陰道超聲引導下穿刺取卵。1.4 觀察指標及方法：陰道B超指引下行穿刺取卵術并留取優勢卵泡的卵泡液。卵泡液1 500r／min離心10min，在沉淀物中加入PBS至5mL制成混懸液。取 15mL離心管并加入人淋巴細胞分離液5mL。將混懸液緩慢加入淋巴細胞分離液面上，1 200r／min離心20min，吸取在兩液面之間的細胞層加PBS 3 000r／min離心 5min，下層即為壁顆粒細胞。標本加入2mL Trizol液（Invitrogen公司）完全裂解后置于－80℃凍存（用于實時熒光定量PCR）。

采用化學發光微粒子免疫測定法測定性激素，由美國ARCHITECT公司提供LH、E2、P試劑盒。按試劑說明書同批專人操作。

1.5 卵泡壁顆粒細胞FoxO1、FoxO3a及FSHR mRNA表達：實時熒光定量PCR法測定。兩組取2μg總RNA反轉錄，分別以人甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyteraldehyde-3-phosphate dehydrvgenase，GAPDH）、FoxO1、FoxO3a及FSHR的特異性引物進行PCR反應。引物序列利用GenBank數據庫中提供的基因序列，經GenBank BLAST進行同源性檢測，用DNAman version 6軟件設計，上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如下。GAPDH-上游，5′-TGAACGGGAAGCTCA-CTGG-3，GAPDH-下游，5′-GCTTCACCACCTTCTTGA TGTC-3′；FoxO1-上游，5′-TGAGGGTTAGTGAGCAGGTTAC-3′，FoxO1-下游，5′-AGGGAGTTGGTGAAAGACATC-3′；FoxO3a-上游，5′-TGCTCACTTCGGACTCACTTAG-3′， FoxO3a-下 游， 5′-GCAAAGGACATCATCGGA-3′；FSHR-上游，5′-ACATCTACCTCACAGTGCGG-3′，FSHR-下游，5′-AAAGAAAGAAATGGGTGCC-3′。ABI 7300型實時熒光定量 PCR儀進行擴增，95℃預變性 5 min，然后 95℃ 15s、58℃ 20s、72℃ 27s反應40個循環。FoxO1、FoxO3a及FSHR mRNA表達量以2－△△CT來表示，其值為以FoxO1、FoxO3a及FSHR的mRNA表達量與GAPDH表達量的比值，再將對照組某某的量設為1，其余樣本的數值與其相除，得到相對定量值。每個目的基因測定重復3次。

1.6 統計學方法：應用SPSS13.0統計軟件進行數據處理。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性采用直線相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組血清LH、E2、P水平及獲卵數、優質胚胎率比較：妊娠組血清E2水平高于未妊娠組，差異有統計學意義（P＜0.01）。妊娠組優質胚胎數多于未妊娠組，差異有統計學意義（P＜0.01）。2組LH、P、獲卵數指標差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 2組取卵日血清LH、E2、P水平及獲卵數和優質胚胎率比較Table 1 Comparison of serum LH，E2，P level，number of eggs，fertilization rate and high embryo quality between two groups（n＝63，）

表1 2組取卵日血清LH、E2、P水平及獲卵數和優質胚胎率比較Table 1 Comparison of serum LH，E2，P level，number of eggs，fertilization rate and high embryo quality between two groups（n＝63，）

LH：luteotropic hormone；E2：estradiol；P：progesterone

Groups LH（U／L） E2（ng／L） P（ng／L） Number of eggs High embryo quality（%，n）Pregnancy 0.891±0.632 3 960.383±232.401 7.92±0.91 13.912±5.722 50.417（363／720）Non-pregnancy 1.162±0.983 3 120.814±306.023 7.83±0.79 12.498±4.213 29.292（203／693）t／χ21.839 17.340 0.593 1.579 65.622 P ＞0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.01

2.2 2組壁顆粒細胞FoxO1、FoxO3a及FSHR mRNA表達比較：126例患者壁顆粒細胞上均有FoxO1、FoxO3a及FSHR mRNA表達。妊娠組FoxO1 mRNA表達高于未妊娠組，差異有統計學意義（P＜0.01）。2組FoxO3a及FSHR mRNA差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 2組壁顆粒細胞FoxO1和 FoxO3a及FSHR mRNA表達比較Table 2 Comparison of FoxO1，FoxO3a and FSHR mRNA expression between two groups（n＝63，）

表2 2組壁顆粒細胞FoxO1和 FoxO3a及FSHR mRNA表達比較Table 2 Comparison of FoxO1，FoxO3a and FSHR mRNA expression between two groups（n＝63，）

Groups FoxO1 mRNA FoxO3a mRNA FSHR mRNA Pregnancy 0.786±0.152 0.923±0.162 0.743±0.238 Non-pregnancy 0.383±0.102 0.842±0.341 0.691±0.372 t 17.474 1.703 0.346 P ＜0.01 ＞0.05 ＞0.05

2.3 相關性分析：126例患者 FoxO1、FoxO3a及FSHR表達相關性分析顯示，FoxO1與FoxO3a相關（r＝0.885，P＜0.01）；FoxO1、FoxO3a與FSHR相關（r＝0.881、0.999，P＜0.01）。

FoxO1、FoxO3a及FSHR表達與血清 LH、E、P水平相關性分析顯示，FoxO1與血清LH、E、 P水平不相關（r＝0.007、0.288、0.024，P＞0.05），FoxO3a與血清LH、E2、P水平不相關（r＝1.000、－0.010、0.222，P＞0.05）；FSHR與血清LH、E2、P水平不相關（r＝0.219、0.177、0.260，P＞0.05）。

3 討 論

FSHR 與卵泡刺激素 （follicle stimulating hormone，FSH）結合并激活環磷酸腺苷／蛋白激酶A下游通路，促進顆粒細胞分化增殖、卵泡發育及成熟［9－10］。FSHR與卵巢反應性密切相關。FSH在這一過程中發揮了重要作用。采用合適的促排卵方案獲得數量適中的優質卵子及胚胎是 IVF治療成功的關鍵。FSH發揮作用要受到FSHR的調節，FSHR屬G蛋白偶聯受體家族成員，特異性地存在于卵巢顆粒細胞中。FSH在生殖方面的重要作用使得FSHR成為臨床上調控生育的一個突出目標，顆粒細胞上FSHR表達情況也因此成為卵泡生長發育的關鍵。本研究中基因表達，2組差異無統計學意義，提示妊娠組優胚數明顯高于未妊娠組，提示妊娠組卵母細胞質量明顯優于未妊娠組，但是FSHR不直接決定卵母細胞質量。而本研究中對FoxO1、FoxO3a與FSHR表達進行相關性分析，發現FoxO1、FoxO3a與FSHR都具有強相關性。提示FoxO信號通路與FSHR的表達功能上密切相關。有研究［11］顯示，FSH通過活化卵巢顆粒細胞磷脂酰肌醇3激酶－絲氨酸激酶通路，調節FoxO1基因轉錄和蛋白的磷酸化，從而對顆粒細胞的增生、分化進行調控。而本研究結果提示，FSHR水平也參與了對FoxO1和FoxO3a基因表達的調節。推測在FSHR及其后的環節FoxO信號通路通過顆粒細胞對卵子的發育、卵巢反應性有重要的調節作用，這一推論還需要更多的實驗驗證。

既往的研究［7］顯示 FoxO1和 FoxO3a是細胞增殖的負調控者，它們的高表達誘導細胞增殖的停止。FoxO1和FoxO3a還是細胞凋亡的誘導者，高表達可以誘導細胞的凋亡［8］。研究［12］顯示，FoxO3a參與小鼠原始卵泡的凋亡調控。人卵巢顆粒上有 FoxO家族基因的表達，包括 FoxO1、FoxO3a、FoxO4。次級卵泡的體外培養還發現，Wnt／β-catenin信號通路通過FoxO3a基因實現對卵泡發育的負調控［13］。基因敲除顆粒細胞FoxO1／3的模型顯示，垂體的FSH受到了調節，因而推測FoxO1和FoxO3a在顆粒細胞上的功能與FSH密切相關［14］。而氧化應激信號可以通過上調顆粒細胞FoxO1的表達誘導凋亡［15］。研究［16］還顯示對FSH信號刺激顆粒的細胞增殖需要解除FoxO1信號的抑制。上述研究均顯示顆粒細胞上FoxO1和FoxO3a抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，并且與FSH對顆粒細胞的調控密切相關。本研究結果顯示FoxO1和FoxO3a與顆粒細胞上FSHR密切相關，從受體的角度提示了FoxO1和FoxO3a與FSH在生殖方面的重要作用的關聯。但是FoxO1在妊娠組的高表達，卻與既往的研究結果不一致。推測以往的研究都在原始和卵泡發育早期，而本研究選取的是晚卵泡期的顆粒細胞，生理情況下這一時期的小FSH峰及高的LH峰共同完成對排卵功能以及卵母細胞成熟的的調節，FoxO1的高表達可能與負調節FSH信號有關，其有關的機制還需要進一步的實驗研究。

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（本文編輯：劉斯靜）

EXPRESSION AND RELATIONSHIP OF FoxO GENE AND FOLLICLE STIMULATING HORMONE RECEPTOR GENE IN HUMAN OVARIAN GRANULOSA CELLS

LIANG Ying1，MI Meiyan2*，LI Shuxian2，ZHOU Li1，WU Xiaoqian1，LEI Lingmei3

（1.Department of Reproductive Center，the Fourth Hospital of Shijiazhuang City，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Gynaecology，the Fourth Hospital of Shijiazhuang City，Shijiazhuang 050011，China；3.Department of Clinical Laboratory，the Fourth Hospital of Shijiazhuang City，Shijiazhuang 050011，China）

ObjectiveTo explore the expression of forkhead box（FoxO）gene and folliclestimulating hormone receptor（FSHR）in human ovarian granulosa cells and their relationship.MethodsOne hundred and twenty-six unfertility women treated with in vitro fertilization and embryo transplantation（IVF-ET）were recruited.According to the pregnancy outcome，the patients were divided into pregnancy groups 63 cases and non-pregnancy group 63 cases.The expressions of FoxO1 mRNA，FoxO3a mRNA and FSHR mRNA on human ovarian granulosa cells were detected by real time fluorescence quantitative PCR.The correlation analysis of FoxO1，FoxO3a，FSHR with serum sex hormones including luteotropic hormone（LH），estradiol（E2），progesterone（P）were mevaluated.ResultsHigh quality embryo number and serum E2level in pregnancy group were significantly higher than those of non-pregnancy group（P＜0.01），butLH，P level and number of eggs showed no significant difference between two groups（P＞0.05）.The expression FoxO1 mRNA in pregnancy group was higher than that of non-pregnancy group（P＜0.01）.The expression of FoxO3a and FSHR mRNA were no statistical difference between pregnancy group and non-pregnancy group（P＞0.05）.The correlation coefficients of FoxO1 and FoxO3a with FSHR were 0.881，0.999（P＜0.01）.ConclusionFoxO1 and FoxO3a genes participate in the regulation of oocyte quality and their functions have closely connected with FSHR.

follicle stimulating hormone，human；cumulus cells；oocytes

R715.9

A

1007-3205（2014）10-1140-04

2014－06－27；

2014－08－19［基金項目］石家莊市科學技術研究與發展計劃項目（11146753）［作者簡介］梁瑩（1975－），女，河北安新人，河北省石家莊市第四醫院副主任醫師，醫學博士，從事生殖醫學研究。

*通訊作者。E-mail：1604092700＠qq.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.008