卵巢癌耐藥細胞株SKOV3／DDP的建立及其與凋亡途徑蛋白的關系

申 薇，梁冰鋒，李秀榮，秦秀紅，程建新

（1.河北醫科大學第四醫院婦產科，河北 石家莊 050011；2.河北女子職業技術學院護理系，河北 石家莊 050091）

卵巢癌耐藥細胞株SKOV3／DDP的建立及其與凋亡途徑蛋白的關系

申 薇1，梁冰鋒2*，李秀榮1，秦秀紅2，程建新1

（1.河北醫科大學第四醫院婦產科，河北 石家莊 050011；2.河北女子職業技術學院護理系，河北 石家莊 050091）

目的 通過順鉑（cisplatin，DDP）誘導卵巢癌細胞珠SKOV3建立耐藥細胞株SKOV3／DDP，并研究其與凋亡途徑蛋白的關系。方法 應用倒置顯微鏡觀察 DDP對細胞形態的影響，四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測DDP對SKOV3和SKOV3／DDP細胞的增殖抑制情況，流式細胞術（flow cytometry，FCM）檢測細胞凋亡率以及細胞中X鏈鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor-of-apoptosis protein，XIAP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（cysteine-aspartic acid protease-3，Caspase-3）、B細胞淋巴瘤／白血病 2（B cell lymphoma／lewkmia-2，Bcl-2）和生存素（Survivin）的表達情況。結果 MTT法檢測發現DDP作用后，SKOV3／DDP細胞的增殖抑制率較SKOV3細胞顯著降低（P＜0.01），且存在著濃度和時間依賴效應（P＜0.01）。由半數抑制濃度（50% concentration of inhibition，IC50）比較得 SKOV3／DDP細胞 24、48、72h耐藥指數（resistance index，RI）分別為2.434、2.950、3.780。FCM檢測表明，DDP作用后，SKOV3／DDP凋亡率顯著低于 SKOV3細胞（P＜0.01）。與SKOV3細胞相比，SKOV3／DDP細胞中XIAP、Bcl-2、Survivin蛋白高表達，Caspase-3蛋白低表達，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論 成功建立卵巢癌耐藥細胞株 SKOV3／DDP，其耐藥機制可能與 XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的異常表達有關，表明這些蛋白參與了卵巢癌DDP耐藥的形成。

卵巢腫瘤；順鉑；抗藥性，腫瘤

嚴重威脅著女性的生命健康，該疾病5年生存率約為45%，甚至低于25%～30%［1－2］。鉑類藥物如順鉑（cisplatin，DDP）是目前卵巢癌治療的主要藥物之一，由于腫瘤的多藥耐藥性使得DDP在卵巢癌治療中并沒有實質性的進展，嚴重影響了該藥物在臨床上的應用效果［3］。耐藥的相關機制很多，其中耐藥蛋白的異常表達是重要因素之一，X鏈鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor-of-apoptosis protein，

XIAP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（cysteineaspartic acid protease-3，Caspase-3）、B細胞淋巴瘤／白血病2（B cell lymphoma／lewkmia-2，Bcl-2）和生存素（Survivin）是細胞凋亡途徑的重要調節因子，研究發現4種蛋白在多種惡性腫瘤細胞中表達異常，并且參與了腫瘤多藥耐藥性的產生，在惡性腫瘤的發生發展中起了至關重要的作用［4］。因此，建立卵巢癌DDP耐藥細胞株SKOV3／DDP，分析細胞凋亡通路耐藥相關蛋白在卵巢癌DDP耐藥細胞中的表達，研究耐藥機制，對提高抗腫瘤藥物治療的靶向性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株：人卵巢癌SKOV3細胞株由河北醫科大學第四醫院科研中心提供。將人卵巢癌SKOV3細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，在培養瓶內單層傳代培養，37℃、5%CO2培養箱內孵育。

1.1.2 試劑和儀器：注射用DDP購自山東齊魯制藥廠，胰蛋白酶、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液購自美國Sigma公司，PBS、RPMI-1640培養液購自美國 Gibco公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自天津化學試劑廠，胎牛血清購自杭州四季青公司，四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購自洛陽華美生物工程公司，兔抗人 Bcl-2和 XIAP多克隆抗體購自bioworld公司，鼠抗人 Caspase-3和 Survivin單克隆抗體購自北京中杉金橋試劑有限公司。流式細胞儀（Epics-XLⅡ型）購自美國 Beckman Coulter公司；酶標儀（HT2-125500型）購自鄭州博賽生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 耐藥細胞株 SKOV3／DDP的誘導：采用DDP持續接觸濃度遞增的方法對SKOV3細胞株進行誘導，取對數生長期SKOV3細胞，于含有0.02 mg／L DDP的培養基中培養，逐步提高DDP的誘導濃度，直到細胞能在含0.2mg／L DDP的培養基中穩定生長，歷時8個月，將其命名為SKOV3／DDP細胞。

1.2.2 倒置顯微鏡觀察細胞形態：取對數生長期的SKOV3和SKOV3／DDP細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態學變化。

1.2.3 藥敏試驗：采用MTT法檢測SKOV3細胞、SKOV3／DDP細胞對DDP的敏感性。SKOV3／DDP細胞在不含DDP的RPMI-1640培養液中培養2周后備用，取對數生長期的SKOV3、SKOV3／DDP細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用含12%胎牛血清的 RPMI-1640培養液制成單細胞懸液，以8.0×104／孔接種于96孔培養板，每孔 100μL，每組設6個復孔。24h細胞貼壁后，分別加入不同濃度DDP（1、2、4、8、16mg／L），0mg／L DDP組加入生理鹽水。置 37℃、5%CO2條件下分別孵育 24、48、72h后，每孔加入MTT溶液（5g／L）20μL，置37℃、5%CO 條件下繼續孵育4h，終止培養，傾去培養液。每孔加入 150μL DMSO，振蕩 10min。選擇490nm波長，以空白孔調零，在酶標儀上測定各孔光吸收值A490，計算細胞的增殖抑制率和耐藥指數（resistance index，RI）。增殖抑制率＝1－實驗組A490值／對照組A490值；RI＝耐藥細胞半數抑制濃度（50%concentration of inhibition，IC50）／親本細胞IC50。

1.2.4 流式細胞術檢測SKOV3和SKOV3／DDP細胞中蛋白的表達：取生長狀態良好，處于對數生長期的SKOV3和SKOV3／DDP細胞，冷PBS洗滌2次，用0.25%胰蛋白酶消化，4℃預冷的PBS洗2遍細胞后，離心棄去上清液，調整細胞濃度為1×107／mL，向細胞懸液中加入 XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin抗體，避光靜置 30min，加入二抗工作液100μL，對照組只加二抗。室溫靜置30min，上機檢測死亡受體XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivinn表達量，實驗重復3次。

1.2.5 流式細胞術檢測SKOV3和SKOV3／DDP細胞凋亡：取對數生長期的SKOV3和SKOV3／DDP細胞4×105／孔接種于6孔板中，在37℃、5% CO2的培養箱中培養，待細胞貼壁后，設置一個加生理鹽水的空白對照組，其余為不同濃度 0、2、4、8mg／L DDP組，每組設3個復孔，作用48h后收集細胞，并調整細胞數為 1×107／mL，取 100μL細胞懸液向其中加入DNA染液（PI 50mg／L，RNA酶10mg／L及1%Triton-X100）1mL，在4℃冰箱中染色30min，上機檢測凋亡，實驗重復3次。

1.3 統計學方法：應用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析。計量資料以表示，分別采用單因素方差分析、q檢驗和t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 卵巢癌耐藥細胞株SKOV3／DDP的培養：通過8個月的培養，成功獲得了SKOV3／DDP耐藥細胞株。倒置顯微鏡下觀察，SKOV3、SKOV3／DDP細胞均貼壁生長，上皮細胞樣復層生長的SKOV3細胞呈梭形，細胞數目多，透明，排列緊密，細胞圓亮飽滿，細胞間邊界清楚。SKOV3／DDP細胞較SKOV3細胞大，呈多角形，神經元細胞樣生長，體積膨脹，核仁多，細胞質可見顆粒狀囊泡，邊界模糊，折光性差。

2.2 DDP作用于SKOV3和SKOV3／DDP的增殖抑制率：隨著DDP濃度增高，SKOV3、SKOV3／DDP細胞的增殖抑制率呈上升趨勢，同一細胞不同劑量組之間比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；同一時間組比較，SKOV3／DDP細胞的增殖抑制率低于SKOV3細胞，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

DDP作用SKOV3、SKOV3／DDP細胞24、48、72h，SKOV3細胞的 IC50值分別為11.193、5.940、3.031，SKOV3／DDP細胞分別為27.241、17.522、11.456，由 IC50比較得 SKOV3／DDP細胞 24、48、72h RI分別為2.434、2.950、3.780，隨著時間的推移RI逐漸增加。

表1 DDP作用SKOV3和SKOV3／DDP細胞24、48、72h的增殖抑制率Table 1 Proliferative inhibition rate of SKOV3 and SKOV3／DDP cells after DDP treatment for 24，48 and 72h（n＝6，，%）

表1 DDP作用SKOV3和SKOV3／DDP細胞24、48、72h的增殖抑制率Table 1 Proliferative inhibition rate of SKOV3 and SKOV3／DDP cells after DDP treatment for 24，48 and 72h（n＝6，，%）

DDP（mg／L） SKOV3 24h 48h 72h F P 1 13.332±1.211 19.558±1.381 26.774±1.981 111.614 0.000 2 20.848±2.232 29.763±1.228 40.762±2.220 156.861 0.000 4 31.110±2.887 44.884±1.402 65.781±2.852 297.568 0.000 8 42.584±1.679 66.857±1.342 78.849±1.731 806.738 0.000 16 68.209±2.318 83.886±1.961 92.128±3.889 109.167 0.000 F 602.289 1 897.398 617.668 0.000 0.000 0.000 DDP（mg／L） SKOV3／DDP 24h 48h 72h P F P 1 7.234±0.891 10.453±1.317 15.451±1.229 76.404 0.000 2 12.671±1.112 17.891±1.011 23.562±2.548 61.029 0.000 4 19.776±1.881 25.770±1.563 33.879±3.211 55.349 0.000 8 27.219±2.228 34.463±1.451 42.861±2.987 64.776 0.000 16 42.113±2.149 52.227±2.327 67.887±4.223 108.928 0.000 F 367.104 615.364 273.358 P 0.000 0.000 0.000

2.3 SKOV3、SKOV3／DDP細胞中XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的表達：SKOV3／DDP細胞XIAP、Bcl-2、Survivin蛋白表達量顯著高于SKOV3細胞，差異有統計學意義（P＜0.01）；SKOV3／DDP細胞中Caspase-3蛋白的表達量低于SKOV3細胞，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 XIAP、Caspase-3、Bc-I2和Survivin蛋白在SKOV3和SKOV3／DDP細胞中的表達Table 2 Expression of XIAP，Caspase-3，Bc-l2 and Survivin proteins in SKOV3 and SKOV3／DDP cells（n＝6，）

表2 XIAP、Caspase-3、Bc-I2和Survivin蛋白在SKOV3和SKOV3／DDP細胞中的表達Table 2 Expression of XIAP，Caspase-3，Bc-l2 and Survivin proteins in SKOV3 and SKOV3／DDP cells（n＝6，）

XIAP：X-linked inhibitor-of-apoptosis protein；Caspase-3：cysteine-aspartic acid protease-3；Bcl-2：B cell lymphoma／lewkmia-2

Proteins XIAP Caspase-3 Bcl-2 Survivin SKOV3 251.712±7.501 366.812±16.139 328.314±17.302 240.359±10.456 SKOV3／DDP 296.528±11.565 299.093±21.804 399.657±15.037 297.946±15.566 t 7.964 6.115 7.624 7.522 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 DDP對SKOV3、SKOV3／DDP細胞凋亡的影響：DDP作用SKOV3和SKOV3／DDP細胞48h后，隨DDP濃度增高，細胞凋亡率顯著增加，且兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.01）；2、4、8mg／L DDP組SKOV3／DDP細胞凋亡率低于SKOV3細胞，差異有統計學意義（P＜0.01），見表3。

表3 DDP對SKOV3／DDP和SKOV3細胞凋亡率的影響Table 3 Effect of DDP on apoptosis of SKOV3／DDP and SKOV3 cells（n＝6，，%）

表3 DDP對SKOV3／DDP和SKOV3細胞凋亡率的影響Table 3 Effect of DDP on apoptosis of SKOV3／DDP and SKOV3 cells（n＝6，，%）

*P＜0.01vs0mg／L ＃P＜0.01vs2mg／L △P＜0.01vs4mg／L byqtest DDP：cisplatin

Proteins DDP 0mg／L 2mg／L 4mg／L 8mg／L F P SKOV3 1.319±0.96 12.531±1.12*18.867±1.76*＃28.673±3.53*＃△178.043 0.000 SKOV3／DDP 1.669±0.68 6.908±0.56*8.121±0.89*＃19.133±1.12*＃△456.692 0.000 t 0.729 10.999 13.316 6.310 P 0.483 0.000 0.000 0.000

3 討 論

本研究利用藥物濃度逐步遞增的方法，體外誘導培養了卵巢癌DDP耐藥細胞株，即SKOV3／DDP細胞，與SKOV3細胞相比，其細胞體積和形態均發生顯著變化，與李宏等［5］的研究結果類似。DDP作用SKOV3／DDP細胞和SKOV3細胞后，SKOV3／DDP細胞生長抑制率顯著低于SKOV3細胞，由IC50比較得SKOV3／DDP細胞24、48、72h RI分別為2.434、2.950、3.780，說明SKOV3／DDP細胞產生DDP耐藥。

XIAP蛋白是凋亡抑制蛋白家族成員，在免疫逃避、抗細胞凋亡等方面發揮了重要作用，許多惡性腫瘤中 XIAP高表達，且與不良預后具有相關性［6－7］。Survivin是凋亡抑制蛋白 成員之一，Survivin在細胞有絲分裂、增殖過程中起著關鍵性作用，其高表達可增強XIAP的活性，使細胞腫瘤逃避凋亡和轉移［8］。Caspases家族是以酶原形式存在的凋亡過程中的效應蛋白，能通過蛋白酶的水解進行細胞內信號的轉導，在線粒體通路、內質網通路和死亡受體3條通路中均存在Caspase不可逆的激活，最終導致細胞凋亡，且Caspase-3是與凋亡通路最為密切的蛋白［9－10］。Bcl-2基因是細胞凋亡的重要調節基因蛋白，Bcl-2的高表達能夠抑制多種凋亡誘導因素所引發的細胞凋亡，主要通過抑制Caspase-3活性和Caspase-3底物PARP的分解達到抗凋亡的作用，Bcl-2的高表達可致腫瘤細胞耐藥性的增高，是細胞發生耐藥的機制之一［11－12］。本研究采用流式細胞術檢測顯示SKOV3／DDP細胞中XIAP、Bcl-2、Survivin蛋白表達增高，Caspase-3蛋白表達降低，說明DDP在誘導敏感SKOV3細胞產生耐藥過程中，XIAP、Caspase-3、Bcl-2與Survivin均參與了卵巢癌SKOV3／DDP細胞耐藥性的產生。

綜上所述，本實驗所誘導的耐藥細胞株SKOV3／DDP產生DDP耐藥，其機制可能與細胞中凋亡途徑相關蛋白XIAP、Bcl-2與Survivin表達升高和 Caspase-3表達降低有關。耐藥細胞株SKOV3／DDP的建立，為卵巢癌DDP耐藥的進一步研究提供了理想的細胞模型。

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（本文編輯：趙麗潔）

ESTABLISHMENT OF DRUG-RESISTANT CELL LINE SKOV3／DDP FOR OVARIAN CANCER AND ITS RELATIONSHIP WITH APOPTOSIS PATHWAY PROTEINS

SHEN Wei1，LIANG Bingfeng2*，LI Xiurong1，QIN Xiuhong2，CHENG Jianxin1
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；2.Nursing Faculty，Hebei Women Vocational Technology College，Shijiazhuang050091，China）

ObjectiveTo establish drug-resistant cell line SKOV3／DDP through ovarian cancer cell line SKOV3 by induced cisplatin（DDP），and to study its relationship with the apoptosis pathway proteins.MethodsThe inverted microscope was applied to observe DDP influence on the cell morphology.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was used to detect proliferation inhibition rate affected by DDP on SKOV3 and SKOV3／DDP cells.Flow cytometry（FCM）was used to detect the influence of cell apoptosis and the expression of X-linked inhibitorof-apoptosis protein（XIAP），cysteine-aspartic acid protease-3（Caspase-3），B cell lymphoma／lewkmia-2（Bcl-2）and Survivin proteins.ResultsMTT assay showed that proliferation inhibition rate of SKOV3／DDP cells decreased significantly compared with SKOV3 cells after DDP influence（P＜0.01），and depended on the concentration and time（P＜0.01）.The resistance index of DDP to SKOV3／DDP and SKOV3 cells in 24h，48h and 72h were respectively 2.434，2.950 and 3.780 by comparison between 50%concentration of inhibition values.FCM revealed that the apoptosis rates of SKOV3／DDP cells to DDP decreased obviously after 48h than those of SKOV3 cells（P＜0.01）.Compared with SKOV3 cells，the expression of XIAP，Bcl-2 and Survivin proteins in SKOV3／DDP cells were higher，while the expression of Caspase-3 protein was lower，and their differences were statistically significant（P＜0.01）.ConclusionDrug-resistant cell line SKOV3／DDP for ovarian cancer is successfully established and its resistance mechanism is closely related with the abnormal expression of XIAP，Caspase-3，Bcl-2 and Survivin proteins.These proteins might be involved in the drug resistance of ovarian cancer.

ovarian neoplasms；cisplatin；drug resistance，neoplasm卵巢癌是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，臨床早期癥狀隱匿，不易被發現，多以浸潤、轉移和腹腔積液形成為特點，多數患者臨床確診時已為晚期，

R737.31

A

1007-3205（2014）10-1135-05

2014－07－03；

2014－09－02

河北省201 1年醫學科學研究重點課題計劃（20110477）

申薇（1980－），女，天津人，河北醫科大學第四醫院醫師，醫學博士，從事婦科腫瘤疾病診治研究。

*通訊作者

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.007