正交試驗優化超聲輔助提取大花紅景天多糖工藝

周凌云，周 建，阮文懿，王朝清，孫 玉

(1.皖南醫學院 藥學院，安徽 蕪湖 241002；2.無為縣人民醫院，安徽 無為238300)

大花紅景天Rhodiolacrenulata(HK.f.et Thoms.) H.Ohba系景天科紅景天屬多年生藥食兩用草本植物.研究表明，紅景天具有強身、抗缺氧、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、抗微波輻射及興奮大腦和脊髓的作用[1-2].國內外對于大花紅景天多糖提取方法通常采用熱水提取[3]，需要較長的時間和較多的能耗.隨著科學的發展，更多的提取手段被用在植物化學成分提取方面.對于本屬其它植物的多糖成分利用新的手段進行提取也有報道[4-5]，但對于大花紅景天利用超聲波輔助提取優化工藝方法未見報道.本研究通過單因素實驗和正交設計方法，對于大花紅景天的微波輔助提取方法進行了系統的研究，比較了超聲波提取方法和傳統熱水提取方法在多糖得率上的差異，并考察了提取工藝對多糖破壞程度.

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

儀器:KH-400DB型超聲數控清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；UV-5100型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；FA-2400型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；SHZ-III循環水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；旋轉蒸發儀(heidolph laborota 4003)；DZF-6050 型真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司).

材料:大花紅景天根莖(青海西寧唐古風商貿有限公司提供，經皖南醫學院藥學院包淑云副教授鑒定為大花紅景天，留樣于藥物化學教研室)；其余試劑均購于上海國藥集團，均為分析純.

1.2 方法

(1)紅景天多糖含量測定方法的建立.參照黃家錕等人測定紅景天多糖的方法，同法操作，以吸光度A對葡萄糖濃度C進行線性回歸，得回歸方程為：A=0.0168C+0.0342(r=0.9998).實驗表明，葡萄糖在5～60ug/mL范圍呈良好的線性關系.

(2)加樣回收試驗.分別吸取葡萄糖對照品溶液6份，置已知含量的供試品溶液中，按1.2(1)條件測定.測得平均回收率為99.39%，RSD為0.81%，說明用苯酚-硫酸法測定大花紅景天中多糖含量的準確度較高.

(3)提取工藝對多糖破壞程度方法的建立.①參照3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS比色法)，以葡萄糖為標準品，繪制標準曲線，得標準曲線方程為A=0.0165C+0.0459(r=0.9997).通過酸水解多糖提取物，利用總糖質量濃度減去游離單糖質量濃度，計算出多糖得率，可判斷提取工藝對多糖的破壞程度.②根據單糖及多糖在80%乙醇溶解度的差異，將粗多糖用優化后的方法進行提取，提取物用80%乙醇回流1h，濾渣干燥.在相同取樣量和相同分析條件下，比較粗多糖和處理后多糖的質量濃度，判斷提取工藝對多糖的破壞程度.

2 實驗過程及結果

2.1 紅景天粉末的預處理

稱取大花紅景天粉100g，置500mL圓底燒瓶中，將此燒瓶放入加熱回流提取裝置中，依此用500mL石油醚回流提取2次，濾液除去，80%的乙醇回流提取2次，每次1h，最后將殘渣放入60℃的真空干燥箱中烘干，備用.

2.2 傳統水提取工藝

(1)水提取實驗.根據黃家錕、宋學偉等人的正交設計法優化大花紅景天多糖提取工藝的結論，取2g大花紅景天粉末，以料液比1:12，溫度80℃，提取時間為2h處理.將所得提取液濃縮干燥后，取樣，用適量水溶解，定容到100mL, 利用苯酚-硫酸法測量吸光度值為0.1575，得多糖質量濃度為7.34ug/mL，多糖得率為10.29%.

(2)水提取工藝對多糖破壞程度實驗.將2.2(1)剩余粗多糖分為A,B兩組.A組利用DNS比色法，按1.2(3)①操作，得到多糖得率為10.13%，多糖得率與略低于2.2(1)中的10.29%，兩者間的多糖得率差值Δ%=0.16%.B組利用80%乙醇回流，按1.2(3)②操作，測得吸光度值為0.1420，得多糖質量濃度為6.42ug/mL.多糖質量濃度低于2.2(1)中的7.34ug/mL，處理前后的質量濃度差值ΔC=0.92ug/mL.由A,B兩組數據，我們可知在水提過程中，多糖結構遭到了一定程度的破壞.

2.3 超聲波法提取工藝優化

(1)單因素實驗.①超聲提取的溫度考察.精密稱取等量的已處理過的紅景天粉末6份，固定條件在料液比為1:20，時間為30min，提取液乙醇的體積分數為0%，分別控制溫度在50、60、65、70、75、80℃各提取3次.考察溫度對超聲提取的影響，結果如圖1所示.可以看出，溫度的高低直接影響多糖的得率.當溫度為65℃時，多糖得率最高，達到13.44%.因此，最佳超聲溫度為65℃.②超聲提取的時間考察.精密稱取等量的已處理過的紅景天粉末 6份，固定條件在溫度65℃，料液比為1:20，提取液中乙醇的體積分數為0%，分別控制時間在15、20、30、40、50、60min 各提取3次.考察時間對超聲提取的影響，結果如圖2所示.可以看出隨著超聲時間的延長，多糖得率略有提升后便開始下降.這可能是多糖引起的熱量積聚或機械剪切作用導致多糖架構變化而損失.當超聲時間為20min，多糖得率最高，達到14.77%.因此，最佳超聲時間為20min.③提取液中乙醇的體積分數的考察.精密稱取等量的已處理過的紅景天粉末 6份，固定條件在料液比為1:20，時間為20min，溫度為65℃，分別控制提取液中乙醇的體積分數為0%、5%、10%、15%、20%、25%各提取3次，考察提取液中乙醇的體積分數對超聲提取的影響.結果如圖3所示.

圖1 溫度對大花紅景天多糖提取的影響

圖2 時間對大花紅景天多糖提取的影響

圖3 乙醇的體積分數對大花紅景天多糖提取的影響

圖4 料液比對大花紅景天多糖提取的影響

3種大孔吸附樹脂 X-5，S-8，D101 的吸附與解吸實驗表明，洗脫劑中適當增加乙醇的體積分數時，洗脫部分的吸光度和收率均較好，說明一定比例乙醇的存在可能提高多糖的溶解解吸能力.所以，將乙醇的體積分數對多糖溶解的影響作為單因素進行探討.從圖3可以看出，隨乙醇的體積分數的增加，多糖得率先上升后下降，5%時，多糖得率最高，達到12.50%.因此，最佳乙醇的體積分數為5%.④超聲提取的料液比考察.精密稱取等量的已處理過的紅景天粉末 6份，固定條件在時間為15min，溫度為65℃，提取液中乙醇的體積分數為5%，分別控制料液比為1:8，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30各提取3次，考察料液比對超聲提取的影響，結果如圖4.可以看出，液料比在1:8，1:25，1:30時，多糖得率的變化不大，但明顯低于1:10，1:15，1:20.這是因為料液比太低，短時間內多糖的浸提就達到平衡，不利于多糖的進一步溶出.而若料液比太高，濃縮時間過長，容易造成多糖的破壞.而當料液比為1:15時，多糖得率高達20.31%.因此，料液比宜采用1:15.

(2)正交試驗.選取各個因素中3個最佳水平安排正交實驗，得到超聲提取紅景天多糖的最佳工藝條件為A1B2C2D2，即提取溫度為65℃，料液比為1:15，提取時間為20min，提取液中乙醇的體積分數為0%.各個因素對提取結果的影響順序為：料液比>乙醇的體積分數>提取溫度>提取時間.如表1和表2所示.

表1 單因素水平表

表2 正交試驗結果表

(3)驗證實驗.取已預處理過的大花紅景天粉3份，均按照A3B1C1D2工藝條件進行提取，按照1.2(1)中的①項下公式計算多糖得率分別為 15.54%，15.50%，15.52%(RSD=0.13%)，3者均高于正交實驗項下的任一條件下的評分，故驗證該工藝即為大花紅景天超聲提取的最佳工藝.

2.4 提取工藝對多糖破壞程度實驗

(1)3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS比色法).將大花紅景天粉末最佳工藝提取的粗多糖分為兩組，一組用適量水溶解后酸水解作為總糖溶液，一組用適量水溶解后做單糖溶液，分別于DNS試劑反應后測吸光度值，計算出多糖得率為15.35%.本實驗最佳正交條件的得率為15.48%，兩者間多糖得率的差值Δ%=0.13%.此差值與2.2(2)中的A組的差值Δ%=0.16%相比，二者之間差別很小.

(2)80%乙醇回流提取.取等量大花紅景天粉末，按最佳正交條件處理，將所得粗多糖取樣按1.2(1)測定吸光度值為0.7217，得多糖質量濃度為40.92ug/mL.再將剩余粗多糖用80%乙醇80℃回流1h，過濾得濾渣，再次干燥后測吸光度值為0.7122，得多糖質量濃度為40.36ug/mL.處理前后多糖質量濃度差值ΔC=0.56ug/mL.該質量濃度差值與2.2(2)中B組的質量濃度差值ΔC=0.92ug/mL相比較，二者之間差別很小.

以上兩組數據表明，上述兩種提取方法對大花紅景天多糖都有一定程度的破壞.相對傳統水提法，超聲波提取工藝造成的破壞程度更低.

3 討論

超聲波提取技術是利用超聲波的機械粉碎和空化作用，加速浸提物從原料向溶劑的擴散速率，具有提取率高、不需要高溫、能耗低、提取時間大大縮短等優點.本實驗利用超聲波對大花紅景天多糖提取，并采用苯酚-硫酸法測定多糖得率.試驗結果表明，超聲提取大花紅景天的最佳工藝條件是：乙醇的體積分數0%，溫度65℃，超聲時間20min，料液比1：15.由于多糖的不穩定性，各種手段在提取過程對大花紅景天多糖都存在一定的破壞.相比傳統水提法，超聲提取時間短，相對破壞較低.同時，對比傳統水提的多糖得率(10.29%)和超聲波輔助提取的多糖得率(15.48%)，可知，超聲波輔助提取極大提高了大花紅景天多糖的提取率，在大花紅景天多糖的提取上有良好的應用價值.

參考文獻：

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