溫度對果蠅生命周期的影響

李國泰，吳巧玉

(通化師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 通化 134002)

果蠅在分類學(xué)上屬于昆蟲綱(ClassInsecta)有翅亞綱(SubclassPterygota)，雙翅目(Order:Diptera)，果蠅科(FamilyDrosophilidae)果蠅屬(GenusDrosophila)[1].果蠅是一種體長3～4mm的昆蟲，因其常常在腐爛的水果周圍而得名.腐爛的水果上滋生酵母菌，果蠅以酵母菌為食.果蠅是生物學(xué)研究中最重要的模式生物之一，在19世紀(jì)末20 世紀(jì)初，美國學(xué)者M(jìn)organ 選擇黑腹果蠅作為研究對象，通過簡單的雜交及對子代表型計數(shù)的方法，建立了遺傳的染色體理論和基因論，奠定經(jīng)典遺傳學(xué)的基礎(chǔ)并開創(chuàng)利用果蠅作為模式生物的先河[2].模式生物[3]的優(yōu)點主要在于體積小、子代數(shù)量多、易于操作、飼養(yǎng)簡單、反應(yīng)靈敏、生命周期短、成本低廉、繁殖能力強(qiáng)，便于進(jìn)行表型分析，有利于一般的實驗室使用[3].果蠅一直是遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因組學(xué)等多學(xué)科和多領(lǐng)域研究的最為理想而經(jīng)典的實驗材料，還可用來作許多其它方面的實驗材料[4].

果蠅在遺傳學(xué)上通常被用來完成三大定律及伴性遺傳、三點測交、唾腺染色體觀察等實驗，2009 年Toivonen 在研究果蠅胰島素生長因子信號途徑時發(fā)現(xiàn)了果蠅與哺乳類具有高度的保守性，且這一途徑在延長果蠅壽命中扮演著十分重要的角色.目前認(rèn)為果蠅壽命的分子調(diào)節(jié)機(jī)制與人類等哺乳動物可能具有很多的一致性[5].并且利用果蠅實驗檢測環(huán)境物質(zhì)的遺傳和生物效應(yīng)是一項簡易快速的實驗技術(shù)，果蠅壽命是判定被檢物效應(yīng)的指標(biāo)[6].在藥品檢測和食品檢驗實驗中，常用嚙齒類動物(如小鼠)為研究對象，但存在實驗周期長，人力和物力投入大，而且實驗條件不易控制等各種缺點.果蠅因其代謝系統(tǒng)、生理功能、生長發(fā)育等同哺乳動物基本相似，同時具有生存期短、繁殖量大、飼養(yǎng)簡便、反應(yīng)靈敏等優(yōu)點，因而可以用于類似的研究中[7].本文研究的目的在于通過不同的溫度來測試果蠅對低溫和高溫的耐受程度，以及其壽命的長短，可以為果蠅方面的實驗研究提供參考數(shù)據(jù).染色體的結(jié)構(gòu)變異在進(jìn)化和品種的演化中可能起著十分重要的作用[8].果蠅的染色體在減數(shù)分裂時，形狀很小，不易研究.可是在幼蟲的唾液腺細(xì)胞中，核特別大，其中的染色體比減數(shù)分裂時的染色體和其它體細(xì)胞的染色體要大上幾百倍[9].兩條同源染色體間有差別時很容易看出，所以唾液腺染色體是研究染色體畸變的好材料.

實驗的主要方法是對野生型、黑體、白眼、殘翅、白眼小翅焦剛毛型果蠅,分別在60℃,50℃,45℃,40℃,35℃,30℃,25℃,0℃,-20℃,-70℃的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)或處理，并且觀察其生命周期的長短.

1 實驗材料

本實驗采用的研究對象為野生型果蠅、黑體果蠅、白眼果蠅、殘翅果蠅和白眼小翅焦剛毛型果蠅.這些果蠅由生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)實驗室提供.

2 實驗方法及處理過程

2.1 培養(yǎng)基的配制

培養(yǎng)基配方如表1所示，配制時先將其水平均分成兩份，其中一份用于加熱溶解瓊脂和糖，另外一份煮玉米粉，兩份分別溶解煮好后再合到一起煮沸，關(guān)掉火后再加入丙酸，這時培養(yǎng)基很粘稠，要充分?jǐn)嚢柚笤俜盅b培養(yǎng)瓶.培養(yǎng)基冷卻之后，在培養(yǎng)基表面撒上一層酵母粉，插上一塊經(jīng)滅菌的濾紙片作為幼蟲化蛹的干燥場所，然后再塞上棉塞.

2.2 培養(yǎng)瓶滅菌

經(jīng)常用來飼養(yǎng)果蠅的是廣口瓶和指管.根據(jù)實驗的特點和所需果蠅的數(shù)量來決定采用哪種規(guī)格的培養(yǎng)瓶.實驗室最常用的是125ml和60ml廣口瓶作培養(yǎng)瓶.不管是哪種培養(yǎng)瓶，包括瓶塞在內(nèi)使用之前必須經(jīng)過高壓滅菌，滅菌溫度121～125℃，時間20min.

2.3 果蠅的培育

向新配制的培養(yǎng)基中放入親本雌雄成蟲，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～8d，放出親本，繼續(xù)培養(yǎng)3～4d后，得到生命力強(qiáng)，健康的成蟲用于實驗研究的材料.

表1 果蠅培養(yǎng)基配方

(1)第一階段胚胎發(fā)育.經(jīng)過22h發(fā)育后的胚胎角質(zhì)層，在經(jīng)過卵細(xì)胞受精，精卵細(xì)胞核融合以后，細(xì)胞核很快就開始連續(xù)同步分裂，但是這些細(xì)胞核處在同一細(xì)胞膜里.可以說這是個多核細(xì)胞胚胎.稱之為“合胞體胚盤”.在經(jīng)過第七次核裂后，這些細(xì)胞核會游離到細(xì)胞膜下.在第九和第十次核裂的時候，八到十個核開始自行分裂.這些細(xì)胞會成為生殖細(xì)胞，稱為極細(xì)胞.產(chǎn)卵后2.5h至3h，合胞體胚盤的細(xì)胞膜向內(nèi)折疊包繞各個細(xì)胞核，成為“細(xì)胞胚盤”.至此，果蠅胚胎細(xì)胞的第一層單層表皮形成.細(xì)胞核也開始轉(zhuǎn)向非對稱型分化.其分化方向與該細(xì)胞在胚胎中所處的位置有所關(guān)聯(lián).腹側(cè)延長軸的卵裂標(biāo)志著原腸胚開始形成，在原腸胚中會形成三個胚層：腹側(cè)的卵裂形成中胚層.腹溝的前段內(nèi)陷，形成口道.腹溝的后側(cè)內(nèi)陷則形成肛窩，與后來形成的內(nèi)胚層分開.胚胎外層的細(xì)胞和口道，肛窩末端的細(xì)胞內(nèi)陷形成外胚層.隨著胚帶的延長，后段的極細(xì)胞開始向胚胎內(nèi)分裂.器官的分化就開始了，分節(jié)現(xiàn)象已經(jīng)可以看到.在受精大約7.5h后胚帶開始縮短，結(jié)束于背向閉合.受精后22h，經(jīng)過一系列的分化發(fā)展，幼蟲就會發(fā)育并形成(圖1).

(2)第二階段幼蟲發(fā)育.幼蟲能在幾天內(nèi)通過進(jìn)食的方式，從卵體大小為0.5mm長到正常形態(tài)大小為2.5mm.其間蛻皮兩次，所以可以將它的幼體發(fā)育分成三個階段,分別是一齡幼蟲、二齡幼蟲、三齡幼蟲(圖2).

圖1 果蠅的二齡幼蟲 圖2 果蠅的三齡幼蟲

圖3 果蠅的蛹

(3)第三階段蛹化.晚期三齡幼蟲從食物中爬出，尋找合適的干燥的位置并化蛹.幼蟲身體縮短，角質(zhì)層與表皮逐漸分離成為蛹?xì)ぃ?jīng)過五天的變態(tài)發(fā)育，最終破蛹而出，形成成蟲.蛹?xì)な前胪该鞯模庶S褐色，或深黃褐色，長橢圓形(圖3).

(4)成蟲.野生型的果蠅具有深紅色的復(fù)眼，灰褐色的身體，一對長翅膀，全身具有直立的剛毛(如圖4).成蟲的繁殖能力強(qiáng)，每只雌蠅平均每天可產(chǎn)20個卵，最高可產(chǎn)80個.生活周期短，恒溫25℃時一個世代平均約10d.染色體數(shù)目是2n=8，而且其形態(tài)特點十分明顯[10].果蠅屬于多細(xì)胞生物 ,具有生存周期短、飼養(yǎng)簡便、反應(yīng)靈敏、繁殖量大等特點 ,而且其代謝系統(tǒng)、生理功能、生長發(fā)育等生理特性同哺乳動物的基本相似，由于果蠅突變型較多，如白眼果蠅、小翅果蠅、殘翅果蠅及黑體果蠅等，所以是實驗研究絕佳的材料(圖4～7).

圖4 野生型雄果蠅 圖5 野生型雌果蠅

圖6 白眼小翅雌果蠅 圖7 黑體雄果蠅

3 實驗結(jié)果及分析

3.1 實驗結(jié)果

在60℃條件下，野生型果蠅存活5.5min,黑體果蠅存活6min，白眼果蠅存活5min，殘翅果蠅存活4min，白眼小翅焦剛果蠅毛存活6.5min.在50℃條件下，野生型果蠅存活12min，黑體果蠅存活12min，白眼果蠅存活10min，殘翅果蠅存活10min，白眼小翅焦剛毛果蠅存活14min.在45℃條件下，野生型果蠅存活14min，黑體果蠅存活13min，白眼果蠅存活15min，殘翅果蠅存活10min，白眼小翅焦剛毛果蠅存活25min.在40℃條件下，野生型果蠅存活120min，黑體果蠅存活60min，白眼果蠅存活60min，殘翅果蠅存活45min，白眼小翅焦剛毛果蠅存活110min.在35℃條件下，野生型果蠅存活27d，黑體果蠅存活23d，白眼果蠅存活25d，殘翅果蠅存活24d，白眼小翅焦剛毛果蠅存活26d.在30℃條件下，野生型果蠅存活28d，黑體果蠅存活24d，白眼果蠅存活25d，殘翅果蠅存活25d，白眼小翅焦剛毛果蠅存活26d.在0℃條件下，野生型果蠅存活420min，黑體果蠅存活450min，白眼果蠅存活180min，殘翅果蠅存活90min，白眼小翅焦剛毛果蠅存活197min.在-20℃條件下，野生型果蠅存活70min，黑體果蠅存活71min，白眼果蠅存活45min，殘翅果蠅存活30min，白眼小翅焦剛毛果蠅存活46min(表2).

3.2 結(jié)果分析及討論

從實驗研究的數(shù)據(jù)可以看出，自25～60℃的溫度變化過程中，隨溫度的升高，果蠅生存時間在縮短.自25～-20℃的變化過程中，果蠅的生存時間也在縮短，而且從實驗數(shù)據(jù)上可以看出各種突變型果蠅及野生型果蠅中，野生型果蠅生命力最強(qiáng)，殘翅果蠅生活力最弱，最適宜的生存溫度是25℃，最長壽命是33d，60℃高溫下平均存活時間5.4min，由此得出結(jié)論，果蠅對溫度的變化很敏感.高溫下生存時間較短.

而實驗中，在-70℃培養(yǎng)環(huán)境下，所有果蠅在1h之后出現(xiàn)死亡特征，但再放在室溫環(huán)境下放置24h以后，個別果蠅出現(xiàn)復(fù)活現(xiàn)象.復(fù)活后的果蠅進(jìn)行培養(yǎng)繁殖時沒有成功，可能是新陳代謝機(jī)制受到低溫的影響.在培養(yǎng)瓶培養(yǎng)4d左右全部死亡.果蠅之所以出現(xiàn)復(fù)活這種現(xiàn)象可能有以下幾種原因：第一是果蠅的代謝系統(tǒng)產(chǎn)生了應(yīng)急冷蛋白，保護(hù)了他的生命特征.第二是果蠅在環(huán)境的影響下出現(xiàn)的假死現(xiàn)象，逃避環(huán)境的傷害.

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