不同微創介入治療原發性肝癌對機體T細胞免疫功能的影響

韓聚強，范公忍，任永強，郭漢斌，李國安，夏長虹，王帥，龔麗娟，曹建彪

·腫瘤介入Tumor intervention·

不同微創介入治療原發性肝癌對機體T細胞免疫功能的影響

韓聚強，范公忍，任永強，郭漢斌，李國安，夏長虹，王帥，龔麗娟，曹建彪

目的探討微創介入治療肝癌對機體T細胞免疫功能的影響。方法肝動脈栓塞化療（TACE）治療肝癌31例，射頻消融（RFA）治療肝癌19例，根據腫瘤直徑大小分為小肝癌組（直徑≤5 cm）和大肝癌組（直徑＞5 cm）。分別于術前及術后1、7 d留置外周血，用流式細胞術檢測CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值的變化。結果小肝癌組，TACE與RFA治療術后1 d外周血T細胞亞群無明顯變化，但術后7 d時，RFA治療組外周血T細胞亞群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值較治療前相比明顯增高，而TACE組外周血T細胞亞群CD4及CD4/CD8比值較治療前明顯下降。大肝癌組，無論TACE還是RFA治療，術后1 d外周血T細胞亞群指標較治療前明顯下降（P＜0.05），而7 d后外周血T細胞亞群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值較治療前顯著增高，其中RFA組T細胞亞群較TACE組恢復更為顯著。結論不同微創治療方式治療肝癌后對機體T細胞免疫系統影響不同，與腫瘤大小密切相關。

肝細胞癌；肝動脈栓塞化療術；射頻消融治療術；免疫功能

近年諸多研究證實，肝動脈栓塞化療（TACE）治療乙型肝炎相關肝癌術后會出現乙型肝炎病毒（HBV）反彈［1］。我們前期工作也已證實，TACE及射頻消融（RFA）治療均可導致HBV反彈，其中腫瘤直徑大小為單獨影響因素。綜上推測，上述現象可能與微創介入治療術后機體免疫功能改變有關［2］。基于此，我們將肝臟腫瘤直徑大小分作為分層分析依據，進一步觀察了TACE治療31例和RFA治療19例后對機體T細胞免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料2012年6月至于12月在北京軍區總醫院肝病科住院接受治療的HBV相關肝癌患者50例，所有患者均行肝穿活檢病理證實為肝細胞性肝癌。其中男45例，女5例，年齡28～72歲，平均年齡55歲。肝功能Child-Pugh分級A級41例，B級9例。治療前接受核苷類抗病毒治療39例（規范服藥療程均在3個月以上），未接受治療11例。所有患者根據腫瘤直徑大小劃分為小肝癌（直徑≤5 cm）和大肝癌（直徑＞5 cm）組。

1.1.2 主要試劑及儀器淋巴細胞分離液（Ficollhypque液）:天津TBD生物技術發展中心；IgGr1-FITC/IgGr2a-PE、CD3-FITC/CD4-PE、CD3-FITC/ CD8-PE和FACS Lysing Solution溶血素:BD公司生產；流式細胞儀（FCM）Calibur:BD公司生產。

1.2 方法

1.2.1 TACE（31例）采用Seldinger改良技術，經皮右股動脈穿刺將導管選擇性插入肝固有動脈或超選擇性插入到腫瘤供血靶動脈后，造影觀察腫塊大小、部位及血供情況。化療方案采用吡柔比星（20～40 mg），奧沙利鉑（50～100 mg）、5-氟尿嘧啶（500 mg）。以適當速度注入上述藥物與液態碘化油的混合物，再注入明膠海綿顆粒進行栓塞，將靶動脈閉塞。

1.2.2 RFA（19例）患者術前禁食、肌注鹽酸哌替啶25mg、鹽酸異丙嗪25 mg，于常規腹部B超引導下將RFA電極準確刺入腫瘤部位，張開多個子電極呈傘形鎖定腫瘤。RFA儀在計算機控制下發出射頻脈沖，使腫瘤組織產生局部高溫（70℃～95℃）。

1.2.3 FCM檢測CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值分別于術前及術后1、7 d抽取患者血樣，用淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離外周血中有核細胞，外周血中有核細胞染色標記30 min，溶血10 min，300 g離心5 min，棄上清液，PBS洗2次，隨后上機檢測，并采用Cellquest軟件進行樣品測定分析。

1.3 統計學分析

采用Excel 2007建立數據庫，采用SPSS15.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗進行統計學分析，檢測水準α=0.05。

2 結果

2.1 一般臨床資料比較

根據腫瘤直徑大小將所檢測樣本進行分層，RFA組和TACE治療組中肝癌大小患者之間性別構成、年齡、血清AFP水平、肝功能Child-Pugh分級、包膜完整性及腫瘤病理學分級差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 不同微創介入治療原發性肝癌后肝功能損傷的比較

不管RFA還是TACE治療，大肝癌治療后近期肝功能的損傷明顯高于小肝癌組。縱向比較發現，無論大肝癌還是小肝癌組，TACE對肝臟功能的近期損傷明顯高于RFA組。見表1、表2。

表1 RFA治療原發性肝癌前后肝功能損傷變化（±s）

表1 RFA治療原發性肝癌前后肝功能損傷變化（±s）

注:a各組術后與治療前相比，P＜0.05；b各組術后與治療前相比，P＜0.01

組別ALT/（u/L）TBIL/（μmol/L）ALB/（g/L）AST/（u/L）腫瘤直徑≤5 cm（9例）術前43.15±4.42 26.18±6.45 32.49±8.23 46.28±3.62術后1 d 48.49±5.21a25.43±7.29 33.14±5.45 45.23±6.32術后7 d 42.26±6.38 24.96±7.42 31.99±6.45 45.75±8.14腫瘤直徑＞5 cm（10例）術前60.12±10.35 36.58±7.24 31.25±7.33 66.48±8.39術后1 d 98.34±9.21b45.43±8.34b29.44±6.87 74.38±10.12b術后7 d 69.18±8.48a39.77±6.49a30.92±7.18 55.78±9.36a

2.3 不同微創介入治療后外周血細胞免疫功能的比較

2.3.1 RFA治療原發性肝癌前后外周血T細胞亞群的變化小肝癌組，RFA治療1 d后外周血T細胞亞群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值均無明顯變化，而7 d后外周血T細胞亞群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值均較治療前相比明顯增高（P＜0.05）。大肝癌組，RFA治療1 d后外周血T細胞亞群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值較治療前明顯下降（P＜0.05），而7 d后外周血T細胞亞群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值與治療前比較明顯增高（P＜0.01）。見表3。

表2 TACE治療原發性肝癌前后肝功能損傷變化（±s）

表2 TACE治療原發性肝癌前后肝功能損傷變化（±s）

注:a各組術后與治療前相比，P＜0.05；b各組術后與治療前相比，P＜0.01

組別ALT TBIL ALB AST腫瘤直徑≤5 cm（20例）術前44.34±5.79 22.47±4.68 33.14±5.73 46.34±6.42術后1 d 56.24±5.91a23.54±6.17 31.89±6.94 47.21±4.39術后7 d 45.35±7.43 23.14±8.77 32.37±6.54 45.28±0.34腫瘤直徑＞5 cm（11例）術前54.83±7.45 30.63±5.29 31.85±5.96 64.39±9.22術后1 d 153.18±20.91b49.52±7.47b27.89±7.74a127.45±14.45b術后7 d 75.59±9.16a39.51±9.17a29.01±6.51a75.58±7.94a

表3 RFA治療原發性肝癌前后外周血T細胞亞群變化（±s）

表3 RFA治療原發性肝癌前后外周血T細胞亞群變化（±s）

注:a各組術后與治療前相比，P＜0.05；b各組術后與治療前相比，P＜0.01

組別CD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+腫瘤直徑≤5 cm（9例）術前63.15±10.24 27.92±7.34 24.09±6.56 1.08±0.34術后1 d 62.97±9.31 29.02±6.53 23.66±5.34 1.10±0.41術后7 d 64.46±10.38 37.38±6.85a22.89±5.79a1.63±0.44a腫瘤直徑＞5 cm（10例）術前53.15±6.18 26.33±5.76 24.32±5.42 1.17±0.38術后1 d 51.84±7.21 24.35±4.89a22.63±6.04a0.94±0.34a術后7 d 52.16±5.44 33.38±5.73b27.56±5.83b1.43±0.52b

2.3.2 TACE治療原發性肝癌前后外周血T細胞亞群的變化小肝癌組，TACE治療1 d后外周血T細胞亞群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值均無明顯變化，而7 d后外周血T細胞亞群CD4及CD4/ CD8比值較治療前相比明顯下降（P＜0.05）。大肝癌組，TACE治療1 d后外周血T細胞亞群CD3、CD4及CD4/CD8比值較治療前明顯下降（P＜0.01），但7 d后外周血T細胞亞群CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值較治療1 d后有所升高，但較治療前仍有所下降（P＜0.05）。見表4。

2.4 不同微創介入治療肝癌后外周血CD4/CD8比值的變化

以CD4/CD8細胞比值為中心的免疫調節是機體維持免疫平衡的關鍵環節。我們以腫瘤直徑大小進行分層分析，結果發現:①小肝癌組，經TACE治療后CD4/CD8細胞比值呈輕微下降趨勢，而RFA治療后CD4/CD8細胞比值呈明顯上升的趨勢。在治療后第7天，RFA治療組CD4/CD8細胞比值顯著高于TACE治療組（P＜0.05）。見圖1。②直徑大于5 cm的肝癌，兩種微創介入治療后CD4/CD8細胞比值均呈先下降再逐漸升高的趨勢，但在治療后第7天，RFA治療后CD4/CD8細胞比值恢復上升趨勢同樣顯著高于TACE治療組（P＜0.05）。見圖2。

表4 TACE治療原發性肝癌前后外周血T細胞亞群變化（±s）

表4 TACE治療原發性肝癌前后外周血T細胞亞群變化（±s）

注:a各組術后與治療前相比，P＜0.05；b各組術后與治療前相比，P＜0.01

組別CD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+腫瘤直徑≤5 cm（20例）術前64.24±8.34 29.12±6.54 29.33±5.86 1.07±0.42術后1 d 63.97±5.91 28.54±7.32 28.65±4.89 1.03±0.39術后7 d 64.35±6.83 27.38±6.77a28.89±6.87 0.98±0.34a腫瘤直徑＞5 cm（11例）術前54.32±7.15 26.12±4.54 23.41±7.24 1.20±0.35術后1 d 43.97±5.91b19.44±7.32b23.19±3.67 0.87±0.29b術后7 d 46.35±6.83a22.38±6.77a22.15±3.23a1.03±0.42a

圖1 不同微創治療小肝癌后外周血CD4/CD8比值的變化

圖2 不同微創治療大肝癌后外周血CD4/CD8比值的變化

3 討論

機體免疫功能與腫瘤的發生、發展及轉歸關系密切，其中T細胞免疫在機體抗腫瘤的免疫調節中重要作用［3］。臨床上通過測定CD4、CD8等T細胞數值以及CD4/CD8細胞比值來判斷機體維持免疫平衡狀態:當CD4細胞下降、CD4/CD8比值下降或CD8上升時，機體免疫功能下降；相反，當CD4細胞上升、CD4/CD8比值上升或CD8下降時，則提示機體免疫功能好轉或恢復。

介入治療是近年興起治療肝癌的有效微創方法，包括TACE、RFA等，其對于小肝癌或早期肝癌的療效相當顯著［4］，但介入治療對機體免疫功能的影響目前觀點不一。比如TACE，單純從治療本身分析，肝癌供血動脈栓塞后，腫瘤細胞發生壞死，因此其釋放的腫瘤抑制因子減少，從而減弱了對機體免疫功能的抑制［5］。但有臨床研究表明，肝動脈栓塞化療后機體的免疫功能顯著降低［6-7］。究其原因，大部分肝癌患者就診時已到中晚期，多為巨塊型肝癌，或存在血管受壓移位、變異，很難做到主要載瘤動脈的栓塞，因此栓塞化療的同時，部分正常肝組織受損明顯，而目前已證實，肝臟是機體最大的免疫器官，因此過分的栓塞化療可能是導致機體免疫功能下降的主要原因。這一點在我們的研究結果中也得到很好的體現。相反，目前多項研究提示RFA治療能夠增強機體細胞免疫功能［8-9］，具體機制目前尚不明了，分析原因可能如下:①RFA治療后引起部分或全部腫瘤變性壞死，一定程度上減輕了腫瘤負荷，消除了體內腫瘤免疫抑制因子來源，解除了對宿主免疫抑制作用。②RFA治療后，變性壞死的腫瘤細胞暴露其表面腫瘤抗原決定簇，增強了免疫原性，刺激產生特異性和非特異性抗腫瘤免疫，從而改善機體的免疫功能。③加溫是一種物理性的損傷因素，可引起非特異性炎性反應，同樣可以刺激機體免疫系統。④高溫熱療可以促進腫瘤組織合成一種熱休克蛋白，其在細胞內形成復合物，從而被T淋巴細胞識別，產生特異性免疫反應。⑤RFA治療產物高溫可導致機體內P53蛋白穩定性增加，同時啟動細胞凋亡基因或自噬基因表達增強，進一步減輕了瘤負荷［10］。

隨著微創介入治療技術的成熟，目前臨床上也逐漸擴大了TACE或RFA治療肝癌的適應證，由原來的小肝癌向大肝癌、單一介入技術到多種介入技術及微創介入治療與全身靶向治療的聯合［11］。理論上，上述聯合具有很好的依據。此外，在治療過程中除了關注對腫瘤的毀損效果外，人們也越來越注意到各種影響因素對微創治療療效的影響以及微創治療本身對全身免疫系統的影響。本研究中，我們將腫瘤大小作為影響因素進行了分層分析，結果發現腫瘤大小在評估微創介入治療對機體免疫系統的影響極大。鑒于此次研究的樣本量相對較少，我們目前仍在繼續擴大樣本量，進一步探討微創介入對機體免疫功能的影響及分子機制，為將來微創介入治療方案的優化組合提供理論依據。

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The influence of different m icro-injury interventional treatments on the T lymphocyte immune function in patients w ith primary hepatocellular carcinoma

HAN Ju-qiang，FAN Gong-ren，REN Yong-qiang，GUO Han-bin，LIGuo-an，XIA Chang-hong，WANG Shuai，GONG Li-juan，CAO Jian-biao. Institute of Liver Disease，General Hospital of Beijing Military Region，Beijing 100700，China

HAN Ju-qiang，E-mail:hanjq@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the influence of differentmicro-injury interventional treatments on the T lymphocyte immune function in patientswith primary hepatocellular carcinoma（HCC）.M ethods A total of 50 patients with pathologically-proved HCC were enrolled in this study.Transcatheter arterial chemoembolization（TACE）was carried out in 31 patients，while radiofrequency ablation（RFA）was performed in 19 patients.According to the tumor’s diameter，the patients were divided into small HCC group（≤5 cm）and larger HCC group（＞5 cm）.Peripheral blood was taken before and one，seven days after the treatment to determine CD3，CD4，CD8 as well as the ratio of CD4/CD8 using flow cytometry assay.The results were analyzed.ResultsOne day after either TACE or RFA treatment in small HCC group，T lymphocytes in peripheral blood，including CD3，CD4，CD8 as well as the ratio of CD4/CD8，were kept at the same levels as before.However，seven days after the treatment T lymphocytes（including CD3，CD4，CD8 as well as the ratio of CD4/CD8）were significantly increased in RFA group，while T lymphocytes were obviously decreases in TACE group.One day after either TACE or RFA treatment in larger HCC group，T lymphocytes showed a remarkable decrease in both groups（P＜0.05），while seven days after the treatment T lymphocytes and the ratio of CD4/CD8 increased significantly，especially in RFA group.ConclusionThe differentmicro-injury interventional treatments carry different influences on the T lymphocyte immune function in patients with primary hepatocellular carcinoma，which may be related to the size of tumor.（J Intervent Radiol，2014，23:218-221）

hepatocellularcarcinoma；transcatheter arterial chemoembolization；radiofrequency ablation；immunological function

R735.7

A

1008-794X（2014）-03-0218-04

2013-08-20）

（本文編輯:俞瑞綱）

國家自然科學基金（30972594）；王寶恩肝纖維化基金（2010-14）

10.3969／j.issn.1008-794X.2014.03.009

100700北京北京軍區總醫院全軍肝病中心

韓聚強E-mail:hanjq73＠hotmail.com