經脾與經肝種植VX2瘤株建立兔肝轉移瘤模型的影像學比較

史博，李智崗，王永中，吳勇超，郝曉光，谷鐵樹

·實驗研究Experimental research·

經脾與經肝種植VX2瘤株建立兔肝轉移瘤模型的影像學比較

史博，李智崗，王永中，吳勇超，郝曉光，谷鐵樹

目的通過經肝及經脾種植VX2瘤株建立兔肝轉移瘤模型，分別觀察模型建立情況、CT掃描肝內病變數目及強化情況、CT灌注掃描肝內病變與周圍正常肝組織灌注參數（BF值、BV值）差值的比較以及數字減影血管造影（DSA）肝內病變數目及染色情況，探討更為合理實用的方法和更接近人肝轉移瘤模型的建立方法。方法將50只大白兔隨機分為兩組，每組25只。A組暴露肝臟，注入VX2細胞懸液1ml；B組暴露脾臟，注入VX2細胞懸液1ml。術后第14天行CT灌注掃描，第15天行DSA。分別觀察CT掃描表現（肝內病變數目及強化特點）、血管造影表現（肝內病變數目及染色情況）及CT灌注掃描參數[肝內病變處與周圍正常肝組織血流量（BF）和血容量（BV）差值]變化。結果A組25只、B組21只動物成功建模。兩組均有20只動物完成CT灌注掃描及DSA，A組中16只為單個病灶，4只為2個以上病灶，19只可見強化，1只未見強化；B組3只為單個病灶，17只為2個以上病灶，19只可見強化，1只未見強化。A組肝內病變部位與周圍正常肝組織BF值和BV值差值分別為（264.58±59.132）ml/min和（19.541±4.030 0）m l/100 g，B組分別為（199.60±32.237）m l/m in和（15.869±2.891 3）m l/100 g，組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。DSA顯示，A組中13只為單個病灶，6只為2個以上病灶，1只未見明顯病灶，19只可見腫瘤染色，1只未見明顯腫瘤染色；B組中1只為單個病灶，19只為2個以上病灶，全部可見腫瘤染色。結論經肝種植VX2細胞懸液建模的成功率為100%，高于經脾種植VX2細胞懸液（84%）法，后者肝內病變多為多個病灶，大部分有強化，多為環形染色，更接近人肝轉移瘤的影像表現。

肝轉移瘤；VX2瘤株；動物模型

肝臟是惡性腫瘤最易發生轉移的器官之一，在西方國家肝轉移瘤的發病率是原發性肝癌的20倍，在我國兩者的發病率大致相當，但隨著我國乙型肝炎的有效預防，肝轉移瘤比例還將增加［1］，其治療也越來越為臨床醫師重視。制備適合的肝轉移瘤動物模型非常重要，可供臨床和基礎研究，為改進和發展肝轉移瘤的治療以及探索新的治療方法提供良好基礎。目前，通過種植VX2瘤株建立兔肝轉移瘤模型已有應用，但種植方法較多，通常主要有兩種，一種是直接將VX2瘤株種植于兔肝臟，另一種是種植于脾臟，隨之發生肝轉移。兩種方法均可成功建立動物模型，但究竟哪種方法建立的模型更符合人類肝轉移瘤特點，尚無定論。本文通過影像學表現比較兩種建模方法的優劣，為臨床和基礎研究提供數據。

1 材料與方法

50只普通級新西蘭大白兔，雌雄不限，體重2.8～3.5 kg，隨機分為兩組，每組25只。A組麻醉后仰臥位固定，于劍突下腹部正中縱行逐層切開腹壁，暴露肝臟，用1m l注射器斜向穿入肝組織，緩慢注入濃度1×107/m l的VX2細胞懸液1 ml。B組麻醉后仰臥位固定，沿左側肋弓下緣逐層切開腹壁，暴露脾臟（有時需翻轉胃及腸管），牽拉出脾臟，用1 ml注射器斜向穿入脾臟組織，緩慢注入濃度1× 107/ml VX2細胞懸液1m l。接種瘤株后第14天行CT灌注掃描，第15天行數字減影血管造影（DSA）。分別觀察CT掃描表現（肝內病變數目及強化特點）、血管造影表現（肝內病變數目及染色情況）及CT灌注掃描參數［肝內病變處與周圍正常肝組織血流量（BF）和血容量（BV）差值］的比較。

1.1 CT灌注掃描

80 kV，200 mA，層厚2.5 mm，延時5 s，總共掃描時間12 s，灌注掃描間隔時間1 s，共掃描5次，共采集192幅圖，對比劑（碘佛醇注射液350）注射速度為1m l/s，注射總量為4m l。將圖像及數據用CT機軟件包中的肝臟腫瘤灌注模式進行后處理，設定腹主動脈為流入動脈，門靜脈為流入靜脈，分別選取肝內病灶強化最明顯的部位和病灶周圍正常肝組織為興趣區，以掃描時間為橫坐標，密度強度為縱坐標，得到時間-密度曲線（time-density curve，TDC）及相對應的偽彩圖，軟件自動計算出興趣區的灌注參數。

1.2 DSA造影

動物麻醉后仰臥位固定，暴露并穿刺右側股動脈，在透視監視下將Stride微導管分別選入腹主動脈（造影速率2 m l/s，總量4 ml，采集速率3幀/s，采集時間20 s）、腹腔干（造影速率1.5 ml/s，總量4 m l，采集速率3幀/s，采集時間20 s）、脾動脈（造影速率1 ml/s，總量3 m l，采集速率3幀/s，采集時間20 s）及肝固有動脈（造影速率0.5 ml/s，總量2 m l，采集速率3幀/s，采集時間20 s）造影（兔腹腔干及分支解剖與人大致相同），觀察肝臟及脾臟病變血管造影表現。

2 結果

A組25只新西蘭大白兔經解剖病理證實建模全部成功，其中2只在CT灌注掃描后死亡（未行血管造影），2只未能測出CT灌注掃描BV值及BF值，1只在行血管造影前麻醉后死亡；共有20只完成CT灌注掃描及血管造影，并完成所有觀察指標。B組25只新西蘭大白兔中，2只在接種VX2細胞懸液后10 d死亡，2只在接種后12 d死亡，死亡后解剖發現4只均出現腹腔轉移，有大量腹水，肝臟均未見明顯轉移病灶，有21只成功建立模型，其中1只在CT灌注掃描后死亡（未行血管造影）；共有20只成功完成CT灌注掃描及血管造影，并完成所有觀察指標。

A組肝內病變部位與周圍正常肝組織BF值差值為（264.58±59.132）m l/min，B組為（199.60± 32.237）ml/min，組間差異有統計學意義（P=0.01）。A組肝內病變部位與周圍正常肝組織BV值差值為（19.541±4.030 0）m l/100 g，B組為（15.869± 2.891 3）m l/100 g，組間差異有統計學意義（P= 0.003），見圖1。

圖1 CT灌注掃描相對應的偽彩圖

A組20只成功完成CT灌注掃描及血管造影的動物中，16只為單個病灶，4只為2個以上病灶，19只可見強化（其中4只為環形強化），1只未見強化；B組20只中，3只為單個病灶，17只為2個以上病灶，19只可見強化（其中13只為環形強化），1只未見強化。見圖2。

兩組血管造影表現為肝動脈稍增粗，腫瘤血管多較纖細，排列紊亂，腫瘤染色為環形、結節狀及片狀，門靜脈通暢，均未見門靜脈瘤栓及動靜脈瘺。A組20只成功完成CT灌注掃描及血管造影的動物中，13只為單個病灶，6只為2個以上病灶，1只未見明顯病灶，19只可見腫瘤染色（其中5只為環形染色，5只為結節狀染色，9只為片狀染色），1只未見明顯腫瘤染色；B組中，1只為單個病灶，19只為2個以上病灶，全部可見腫瘤染色（12只為環形染色，6只為結節狀染色，2只為片狀染色）。見圖3、4。

圖2 兔肝內腫瘤環形強化

圖3 兔脾臟腫瘤染色

圖4 兔肝內多發轉移瘤灶

3 討論

用兔接種VX2瘤株建立肝臟腫瘤模型的方法已有較多應用，國內外學者有經皮穿刺接種或開腹直視下接種組織塊或細胞懸液，接種于肝臟或脾臟，都能成功建立模型（成功率均在50%以上）［2］，但這種模型更接近于人類哪種肝腫瘤，尚無定論，相關的研究報道也很少。我們通過預實驗發現，根據現有的條件、設備，采用開腹直視下在肝臟或脾臟接種細胞懸液的方法，操作簡便，模型建立周期較短，且成功率高（80%以上）。由于VX2腫瘤細胞株起源于Shope病毒誘發的兔乳頭狀瘤［3］，其病理類型為鱗癌。采用在肝臟接種VX2細胞懸液方法建立的肝腫瘤模型，從病理上看應該為肝轉移瘤，但從其產生途徑及生長方式上來看，似乎更接近于原發性肝癌；在脾臟接種方法建立的肝腫瘤模型，從病理、產生途徑及生長方式上都應該更接近于肝轉移瘤。本實驗通過模型建立情況、CT灌注掃描以及DSA造影表現等方面觀察，得出以下結論。

3.1 肝轉移瘤模型的建立

應用VX2瘤株建立肝轉移瘤模型的方法有很多，根據現有的技術和設備條件，本實驗選擇開腹直視下接種細胞懸液方法。細胞懸液的濃度與模型建立是否成功關系密切，種植的VX2活細胞數≥1×105則成功率可達90～100%，而≤1×104則成瘤率為0；成瘤時間也與接種的細胞數有關，接種細胞少（≥1×105）則成瘤時間長，反之（≥1×106）成瘤時間相對較短［4］。為了保證兩組模型能夠成功建立，本實驗制備待接種的細胞懸液活細胞數為1×107/ml，并且兩組細胞懸液量的選擇均為1 ml。結果A組模型建立成功率為100%，B組為84%，前者明顯高于后者。B組中有3只在接種后不到2周死亡，經解剖發現脾臟已完全為腫瘤組織，與周圍組織粘連，腹腔內可見多發轉移病灶，并且有大量腹水，肝臟并未發現轉移病灶。考慮原因是脾臟血供豐富，腫瘤生長較快，兔脾臟較小，在腹腔內位置相對不固定，周圍被腹膜及腸系膜包裹，容易直接侵犯周圍組織，還未出現肝臟轉移時，動物已死于廣泛的腹腔轉移。根據王曉東等［3］的研究，模型建立成功后進行下一步實驗的時間不宜太晚，本實驗選擇接種后14 d開始進行下一步實驗。

3.2 CT灌注掃描

CT灌注掃描是一種新的功能成像，是基于核醫學計算血流量的原理而發展起來的一種新興技術，除了能顯示靶器官的解剖形態學改變，還能通過測量微循環的血流量來評估該組織的生理或病理狀態，尤其在評價肝臟占位性病變時有較大優勢［5-6］。CT灌注掃描通過軟件獲得所選興趣區的時間密度曲線（TDC），計算出組織BF、BV、對比劑平均通過時間（MTT）、肝動脈灌注指數（HAI）及表面通透性（PS）等參數值，同時可形成彩色灌注圖像，從而更加全面、直觀地了解興趣區的血流灌注特點及血管生長特性［7］。本實驗于接種細胞懸液后14 d行CT灌注掃描，選取肝內病變及周圍正常肝組織為興趣區，根據軟件得出2個興趣區的BF、BV值。A組有2只兔在完成CT灌注掃描后，軟件未能得出興趣區的BF、BV值。考慮原因可能在于實驗動物是在深度麻醉下進行CT灌注掃描，麻醉后呼吸幅度較大，呼吸方式為腹式呼吸，在掃描過程中未能有效屏蔽呼吸，這樣得出的圖像及數據對計算CT灌注參數有影響。由于存在個體差異，本實驗選擇的觀察指標為病變區與周圍正常組織BF、BV的差值。興趣區的選擇對數據有一定的影響，因此為避免呼吸影響，盡量選擇兼顧所有的層面（包含腹主動脈、門靜脈、肝臟內病變及病變周圍正常組織）；選擇病變周圍正常肝組織興趣區時盡量避免包含大血管及病灶周圍的異常強化區；選擇病變興趣區時避免包含成形腫瘤血管。A組病變區與正常組織的BF差值的平均值為（264.58±59.132）ml/min，B組為（199.60±32.237）m l/min，組間差異有統計學意義（P=0.001）；A組病變區與正常組織的BV差值的平均值為（19.541±4.0300）m l/100 g，B組為（15.869±2.891 3）ml/100 g，組間差異有統計學意義（P=0.003）。由此可見，兩組模型肝臟內病變的灌注存在明顯差異，說明應用同樣的瘤株、同樣的活細胞數，接種肝臟和脾臟所建立的肝轉移瘤模型肝臟內病變的血流灌注特點存在差異。

3.3 CT掃描表現

在肝臟病變的診療中CT掃描已成為常規檢查方法之一。過去的普通CT機由于掃描速度慢，對肝臟的病變的診斷受到了一定的影響［7］。而螺旋CT1次屏氣即可完成全肝掃描，結合高壓注射器，已普遍應用于肝轉移瘤的診斷［8］。肝轉移瘤具有多發、大小不等及彌漫分布的特點，并且以內部不明顯增強，邊緣環形增強為主要增強特征［9-10］。本實驗中，A組20只中，16只為單個病灶，4只為多個病灶，19只可見動脈期強化，其中4只為環形強化；B組20只中，3只為單個病灶，17只為多個病灶，19只可見動脈期強化，其中13只為環形強化。由此可見，B組肝內病變以多發、動脈期環形強化為特點，這恰恰與人肝轉移瘤的CT表現特點相似。因此，B組的肝轉移瘤模型更接近于人肝轉移瘤。

3.4 DSA造影表現

DSA造影是利用計算機處理數字化影像信息，以消除骨骼和軟組織影的減影技術，是新一代血管造影的成像技術，已成為全身血管疾病及腫瘤檢查的重要標準之一。血供豐富的肝轉移瘤常與肝細胞癌有相似的造影表現，乏血供的肝轉移瘤造影表現為腫瘤血管纖細、僵直或包繞，實質期腫瘤染色淡薄或不顯影，門靜脈期表現為圓形充盈缺損［5］。VX2瘤株相對惡性程度較高，發展較快，因此模型建成后，應盡量縮短血管造影與CT灌注掃描之間的時間，以提高兩種檢查方法之間的對比性，為避免CT灌注掃描后對比劑存留對血管造影表現的影響以及過量對比劑對動物腎臟的損害，本實驗選擇于CT灌注掃描后1 d行血管造影。兩組模型腹主動脈及腹腔干的造影表現大致相同，腹腔干于第12胸椎至第1腰椎從腹主動脈發出，沿脊柱向上走行，發出脾動脈及肝總動脈，肝總動脈發出肝固有動脈，肝固有動脈稍增粗，肝內腫瘤血管多較纖細，排列紊亂，肝內病灶染色可為環形、結節狀及片狀，門靜脈通暢，顯影較早，均未見門靜脈瘤栓及動靜脈瘺。兔門靜脈顯影較早考慮是因為兔胃腸道較發達，血管更豐富，血流量相對更大，更多的血液會較快的流入門靜脈。兩組肝內病變的血管造影表現存在一定差異，A組肝內病變多為單個病灶，大部分有強化，多為片狀染色；B組肝內病變多為多個病灶，大部分有強化，多為環形染色。兩組共有6只兔CT掃描僅發現單個病變，而血管造影卻發現多個病灶，原因在于DSA造影可以更好的檢出微小病變。由此可見，B組血管造影表現以多發、環形染色為特點，更接近于人肝轉移瘤少血供（血供豐富的肝轉移瘤與原發肝癌相似，不具有轉移瘤的典型表現）肝轉移瘤特點。

總之，經肝種植建立的模型成功率高，并且操作相對簡便（兔脾臟細小，在腹腔內位置不固定，增加手術操作難度），但經脾種植建立的模型的CT及血管造影表現更接近于人類肝轉移瘤，并且通過CT灌注掃描參數的比較，其血流灌注特點明顯不同于經肝種植建立的模型，因此建議在今后的工作中，盡量把經脾種植VX2瘤株建立的肝腫瘤模型作為肝轉移瘤模型研究，由此得出的數據、結論才能更好的為人肝轉移瘤的研究提供參考。

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Rabbit models of liver metastases estab lished by im p lanting VX2tumor into the sp leen or the liver: comparison of radiographicmanifestations

SHIBo，LIZhi-gang，WANG Yong-zhong，WU Yong-chao， HAO Xiao-guang，GU Tie-shu.Department of Radiology，Forth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，Hebei Province 050011，China

LIZhi-gang

ObjectiveTo establish the livermetastasismodel in rabbits by implanting VX2tumor into the liver or spleen，to analyze the model establishment condition，the number and enhancement of hepatic lesions on CT scanning，the number and stain of the lesions on digital subtraction angiography，and to compare the parameters（BF and BV）between pathological tissue and normal tissue of liverwith CT perfusion scanning，and to discuss the reasonable and practicalmethod which can establish themodelmore similar to the human livermetastases.M ethods Fifty white rabbitswere random ly and equally divided into two groups. For the rabbits of group A（n=25），oneml of tumor cell suspension was directly injected into the liver，while for the rabbits of group B，one m l of tumor cell suspension was injected into the sp leen.The rabbits were examined by CT perfusion scanning and DSA at14 and 15 days after the inoculation.CTmanifestations，including the number and enhancement characteristics of hepatic lesions，and DSA manifestations，including the number and stain of the lesions，were analyzed.The parameters of CT perfusion scanning were determined，and BF，BV values between pathological tissue and normal tissue of liver were compared. Results Liver metastasis model was successfully established in 25 rabbits of group A and in 21 rabbits of group B.Twenty rabbits in each group were successfully examined byCT perfusion scan and DSA.In group A，single lesion was seen in 16 rabbits，two ormore lesions in 4 rabbits.Enhancementwas detected in 19 lesions and one lesion showed no enhancement.In group B，single lesion was seen in 3 rabbits，two ormore lesions in 17 rabbits.Enhancementwas detected in 19 lesions and one lesion showed no enhancement.In group A，the difference in BF between pathological tissue and normal tissue of liver was（264.58±59.132）m l/min，while that in group B was（199.60±32.237）m l/min.The difference between the two groups was statistically significant（P＜0.05）.In group A，the difference in BV between pathological tissue and normal tissue of liverwas（19.541±4.030 0）m l/100 g，while that in group B was（15.869±2.891 3）ml/100 g.The difference between the two groupswas statistically significant（P＜0.05）.DSA showed that in group A single lesion was seen in 13 rabbits，two ormore lesions in 6 rabbits and no obvious lesion could be found in one rabbit.Tumor stain was found in 19 rabbits，no obvious tumor stain could be seen in one rabbit.In group B，single lesion was seen in one rabbit，two ormore lesions in 19 rabbits，and tumor stain could be detected in all lesions.ConclusionThe success rate of model establishment by injecting tumor cell suspension directly into the liver was 100%，which is higher than that by injecting tumor cell suspension into the spleen（84%）.The rabbitmodel established by injecting tumor cell suspension into the spleen usually hasmultip le lesions in the liver with ring-shaped enhancement，which ismore similar to the human livermetastases.（JIntervent Radiol，2014，23:236-240）

livermetastasis；VX2tumor；animalmodel

R735.7

B

1008-794X（2014）-03-0236-05

2013-07-19）

（本文編輯:侯虹魯）

10.3969／j.issn.1008-794X.2014.03.014

050011石家莊河北醫科大學第四醫院放射科

李智崗