大連灣石油污染沉積物中細菌群落結構分析

高小玉，明紅霞，陳佳瑩，李江宇，韓俊麗，林鳳翱，樊景鳳*

（1.國家海洋局國家海洋環境監測中心，遼寧大連 116023；2.國家海洋局近岸海域生態環境重點實驗室，遼寧大連 116023；3.大連海洋大學水產與生命學院，遼寧大連 116023）

大連灣石油污染沉積物中細菌群落結構分析

高小玉1，2，3，明紅霞1，2，陳佳瑩1，2，3，李江宇1，2，3，韓俊麗1，2，3，林鳳翱1，2，樊景鳳1，2*

（1.國家海洋局國家海洋環境監測中心，遼寧大連 116023；2.國家海洋局近岸海域生態環境重點實驗室，遼寧大連 116023；3.大連海洋大學水產與生命學院，遼寧大連 116023）

大連新港“7.16”輸油管道爆炸溢油事故發生后，為探究石油污染與細菌群落結構變化之間的關系及在石油生物降解過程中起重要作用的細菌菌群，本研究對大連灣表層沉積物中石油烴含量和細菌宏基因組16S rDNA V3區進行分析。結果表明：溢油初期2010年8月DLW01站位表層沉積物石油烴含量高達1 492 mg／kg，符合第三類沉積物質量標準，隨著時間推移，2011年4月、2011年7月、2011年12月航次各站位沉積物中石油烴含量基本呈下降趨勢，且均符合第一類沉積物質量標準；16S r DNA PCR－DGGE方法分析表明，石油烴含量高的區域優勢細菌種類少，反之則較豐富；海洋環境中同一地點的細菌群落能保持一定穩定性；大連灣石油污染沉積物中變形菌門γ-變形菌綱和擬桿菌門一直保持較高的優勢度，是在石油生物降解過程中起重要作用的細菌菌群，而厚壁菌門只在石油烴含量低的區域出現；此外，出現的對污染物敏感的嗜冷桿菌可作為石油污染指示生物進行深入研究。

細菌優勢種群；石油污染；大連灣；沉積物

1 引言

有調查顯示，石油污染對微生物的群落結構產生一定的影響，而微生物群落結構是海洋生態系統的重要組成部分［1］，微生物在群落水平上通過各種單一功能的種群依次階梯作用完成對環境中的有機物（如石油烴）、氮、磷、硫等污染物的降解［2］。而某種或某類微生物數量或活性的消長都會影響到群落功能的完整性，最終導致生態系統的失衡或破壞。學者們在海洋石油污染細菌群落鑒定以及主要降解菌的分類等方面進行了大量研究［2—4］，也采用了變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）方法，但大部分學者對得到的數據分析不夠透徹，未將各個細菌種屬歸納至門或綱的分類單元，研究結果繁雜、可比性差。而采用DGGE技術結合測序比對、系統發育分析的方法對環境中微生物群落跟蹤調查可清楚了解微生物群落的優勢種群組成及其演替規律。

大連灣位于遼東半島南端，是大連地區黃海沿岸的第一大灣。由于歷史的原因，在海陸運輸接觸點的大連灣周圍，設有造船、石油化工、鋼鐵等工業企業［5］。2010年7月16日，位于大連灣附近的大連新港石油儲備庫輸油管道發生爆炸，大量原油泄漏入海，導致包括大連灣在內的局部海域受到嚴重污染［6］。海洋沉積物是大多數污染物的最終歸宿，泄露到海洋中的石油，通過蒸發、化學聚凝、沉降、吸附等作用最終沉積于海底［7］，而沉積的石油對沉積物中的微生物群落會造成怎樣的影響，同時微生物群落在石油降解中發揮著怎樣的作用呢？為探究這一問題，本文選取2010年大連發生的海洋溢油事故影響海域大連灣為研究海域，首先分析大連灣沉積物樣品中石油烴含量，并采用DGGE結合測序比對、系統發育分析的方法研究其細菌優勢種群，旨在分析石油污染環境中細菌優勢種群結構組成和變化規律，為探究石油污染生物降解過程中起重要作用的細菌菌群提供依據。

2 材料與方法

站位選取按照離岸距離及與溢油爆炸點位置距離不同，在大連灣海區設置DLW01（39°1.541′N， 121°44.801′E）、DLW02（38°58.488′N，121° 45.297′E）和DLW03（38°58.488′N，121°45.297′E）3個站位（圖1），同時也分別代表海灣的3個重要位置—近岸、灣中和灣口，其中灣口DLW03距離爆炸溢油點較近。分別于2010年8月、2011年4月、2011年7月、2011年12月采集了3個站位共12個表層沉積物樣品，每個樣品用箱式采泥器各采集2份（100 g／份），置于冷藏箱中（4℃左右）保存，于24 h內送至實驗室，用于表層沉積物石油烴含量檢測和細菌優勢種群分析。

2.1 表層沉積物的石油烴含量測定

采用紫外分光光度法測定表層沉積物中石油烴的含量，具體操作參照《海洋監測規范》（GB 17378.4 －2007）［8］。

圖1 大連灣沉積物樣品采集站位

2.2 16S rDNA PCR－DGGE分子指紋圖譜技術

2.2.1 微生物宏基因組的提取和PCR擴增

首先，采用凍融和加入SDS、蛋白酶K相結合的方法裂解海洋沉積物中的微生物細胞，然后用酚-氯仿-異戊醇法抽提其宏基因組［9］，電泳純化（DNA凝膠回收試劑盒，天根生物公司），經適當稀釋作為模板，采用巢式PCR擴增16S rDNA的V3區段。細菌16S rDNA的擴增引物為27F（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）和1492R（5′－TACGGT TACCTTGTTACGATCC－3′）；以細菌16S rDNA為模板，擴增其V3區段的引物為F338（5′－TCCTACGGGAGGCAGCAG－3′）和R518（5′－ATTACCG CGG CTGCTGG－3′），PCR試劑均購自TaKaRa公司，PCR反應體系和程序參考前期報道［10］，其中F338需加上GC發卡，防止DNA在變性梯度凝膠電泳中完全解鏈，GC發卡結構序列為5′－CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGC －3′。

2.2.2 變性梯度凝膠電泳條帶的選擇與測序

變性梯度凝膠電泳的凝膠配制及實驗條件見參考文獻［10］。

將DGGE圖譜中12條泳道根據站位劃分為3組，標記組內4個泳道在同一水平線上最清晰的條帶，并用無菌刀片切下凝膠條帶，儲存于1.5 mL的離心管中，加入20μL滅菌的蒸餾水；4℃過夜擴散浸出凝膠中的DNA作為模板，以GC－F338和R518為引物，再重復進行16S rDNA的V3區段的PCR擴增和DGGE操作，純化每條DGGE條帶并保證其質量，最后用不帶GC發卡的F338和R518引物進行PCR擴增［9］，PCR產物與PMD19－T載體連接并轉化到E.coli DH5α感受態細胞中克隆，送生工生物工程（上海）有限公司測序。

2.2.3 數據分析

（1）DGGE條帶測序結果與NCBI數據庫進行比對，確定其在原核生物界的分類地位，收集相似度最高的序列，用Clustal X 1.8和MEGA 4.1軟件采用距離法（Neighbor joining，NJ）建立系統發育樹［11］，將同一分類地位的細菌歸類后，進一步解析DGGE圖譜，定性定量分析環境樣品中的細菌優勢種群組成。

（2）DGGE圖譜經BIO－DAP軟件分析，得到條帶凈光密度值（Net Intensity），根據凈光密度值計算每個樣品中各細菌類群的優勢度Y，計算公式為：

式中，ni為第i種細菌類群的DGGE條帶凈光密度值，N為所有條帶的凈光密度值之和。當Y＞0.01時，該類菌群為優勢種。結合DGGE測序和比對結果，將同一細菌類群的Y值相加得到其優勢度。

（3）根據條帶灰度值計算樣品中細菌群落的香農-威納指數（Shannon-Weaver index，H），分析細菌多樣性。香農-威納指數的計算公式為：式中，Yi為第i種細菌的優勢度，S為細菌種類總數。

（4）DGGE圖譜通過Quantity One軟件采用軌道定量法識別泳道（Lane）、條帶（Band）并匹配（Match）條帶，輸出DGGE圖譜條帶示意圖，并對各個泳道進行UPGMA聚類分析，得出各個樣品的細菌群落差異性和相似性。

3 結果與分析

3.1 石油烴含量

初步調查大連灣3個站位表層海洋沉積物的石油污染狀況，結果表明該海區選擇的3個站位中，DLW01站位沉積物污染較重，2010年8月其石油烴含量高達1 492 mg／kg，符合海洋沉積物質量標準（GB 18668－2002）中第三類海洋沉積物質量標準（≤1 500 mg／kg）［12］，DLW02各航次平均石油烴含量為209.08 mg／kg，低于離爆炸溢油點較近的灣口DLW03站位，其各航次平均石油烴含量為253.95 mg／kg。除2011年8月采集的DLW01站位外，2011 年4月、2011年7月、2011年12月各航次、各站位均符合第一類海洋沉積物質量標準（≤500 mg／kg）［12］，具體結果見圖2。

圖2 大連灣表層沉積物中石油烴含量

3.2 16S rDNA PCR－DGGE結果

變性梯度凝膠電泳分離大連灣表層沉積物中細菌16S rDNA的V3區段，得到的電泳圖譜見圖3。通過DGGE得到的指紋圖譜上每個條帶代表一個微生物優勢菌群，條帶光密度值越大說明該菌群豐度越高，得到的條帶越多說明研究對象多樣性越高，通過測序和序列比對可以得出此細菌優勢種群的種類（見表1和圖4）。經優勢度公式計算，本研究中切割的條帶所代表的細菌均為樣品中的優勢種（Y＞0.01），以變形菌門和擬桿菌門為代表。

圖3 大連灣表層沉積物中細菌群落DGGE圖譜

表1 DGGE條帶測序結果

圖4 大連灣表層沉積物中優勢細菌系統發育樹

圖5 大連灣表層沉積物細菌群落DGGE圖譜的聚類分析

3.3 細菌群落組成變化分析

采用UPGMA聚類分析發現（圖5），大連灣DLW01站位4個航次的沉積物中細菌群落（泳道1、2、3、4）聚為一支，說明DLW01站位4個航次的細菌群落組成具有相似性，表明海洋沉積物中的細菌群落能保持一定穩定性；DLW02、DLW03兩個站位細菌群落比較相近（泳道5、6、8、9、10、11、12聚為一支），其細菌優勢種群較DLW01站位豐富。結合DGGE圖譜中條帶優勢度和條帶測序分析結果（見表1），沉積物中細菌優勢種群和細菌群落結構多樣性（香農-威納指數）的變化如圖6所示。

圖6 大連灣石油烴污染沉積物不同站位（DLW01、DLW02、DLW03）細菌優勢種群的優勢度比例組成

由圖6可以看出，DLW01的細菌優勢種群變化情況是：2010年8月，擬桿菌門（條帶2、6）的優勢度Y 是0.343，變形菌門γ－變形菌綱（條帶5）的優勢度Y 為0.145；2011年4月和7月該站位沉積物中細菌優勢種群基本一致，變形菌門的優勢度超過擬桿菌門；2011年12月，變形菌門γ－變形菌綱（條帶4、5、8；Y ＝0.345）依舊保持優勢，擬桿菌門有所增多（條帶1、12；Y＝0.89），另外出現了變形菌門ε－變形菌綱的菌群（條帶3；Y＝0.153），其條帶凈光密度值較大（見圖3）。該站位細菌群落香農-威納指數隨時間推移呈下降趨勢。

分析DLW02站位的細菌優勢種群演替發現：2010 年8月其細菌優勢種群較為豐富，有變形菌門的γ-變形菌綱（條帶5、15；Y＝0.159）、δ-變形菌綱（條帶11、13；Y＝0.131）、ε-變形菌綱（條帶3；Y＝0.088），以及厚壁菌門（條帶18；Y＝0.049）；2011年4月，其細菌優勢種群只有變形菌門的γ-變形菌綱（條帶5、15；Y＝0.358）和δ-變形菌綱（條帶14；Y＝0.106）；2011年7月其細菌優勢種群豐富，以厚壁菌門（條帶10；Y＝0.237）、擬桿菌門（條帶9、12；Y＝0.142）為主，還有變形菌門γ-變形菌綱（條帶5；Y＝0.123）、ε-變形菌綱（條帶3；Y＝0.85）；2011年12月的細菌優勢種群比例較均勻，但未檢測到厚壁菌門。該站位細菌群落香農-威納指數隨時間推移呈上升趨勢。

DLW03站位的細菌優勢種群不明顯，4個航次中變形菌門的γ-變形菌綱、δ-變形菌綱、ε-變形菌綱，以及擬桿菌門和厚壁菌門均有出現，只是各自所占比例不同（圖6）。該站位香農-威納指數隨時間而波動變化。

4 討論

4.1 石油污染與細菌群落變化

綜上所述，DLW01站位的細菌優勢種群變化為：變形菌門中的γ-變形菌綱一直占優勢地位；擬桿菌門由盛轉衰，最終優勢恢復不明顯；后出現的ε-變形菌綱細菌，優勢較明顯。DLW02站位沉積物中細菌優勢種群以變形菌門為主，擬桿菌門和厚壁菌門也有出現，除變形菌門的γ-變形菌綱外，其他各類細菌的出現不穩定，且優勢度偏小、較平均。DLW03站位自2010年8月至2011年12月，沉積物細菌優勢種群組成基本無改變，變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門均有出現。

在Brito等［13］的研究中發現，紅樹林沉積物經過原油富集后細菌群落多樣性降低。仔細觀察本研究圖6，同一站位的細菌優勢種群在溢油初期（2010年8月）較單調，后期（2011年4—12月）較豐富；石油烴含量高的站位（DLW01）優勢細菌種類少，石油烴含量低的站位（DLW02、DLW03）則豐富。這可能由于石油烴含量高，只有少數幾種細菌能夠存活；而石油烴含量低則對細菌的抑制作用弱，其細菌優勢種群相對豐富。但本研究未發現3個站位的細菌群落結構多樣性變化與石油污染含量之間的關系。

4.2 石油污染與細菌優勢種群

4.2.1 變形菌門與擬桿菌門

在海洋生態系統中多次發現變形菌門和擬桿菌門是占主導地位的細菌類群，其中β-變形菌綱通常在湖泊和河流出現，而α-和γ-變形菌綱經常大量出現在海洋系統［14—15］。如肖慧等［16］調查發現，青島、威海水域夏、冬兩季表層沉積物中變形菌門是主要類群，且γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria）占優勢。

研究表明［17—20］，石油污染海域的變形菌門、擬桿菌門仍能保持其優勢。如Hazen等［17］于2010年的8 月24日在《Science》雜志上發表的“深海油區富含石油烴降解菌”研究中闡述了γ-變形菌門的數量與石油烴含量呈正相關；1997年1月，Nakhodka油輪在日本海失事發生沉船溢油事故10、18、22、29個月后，近岸海水樣品中微生物群落組成主要有嗜細胞菌屬－黃桿菌屬－擬桿菌屬（CFB）；附近海灘殘留的石油污染物中主要是食烷菌（變形菌門γ-變形菌綱）和鞘氨醇單胞菌（擬桿菌門）等烴類降解菌［18］，還有最著名和分布最廣泛的γ-變形菌綱Alcanivorax．bor犽umensisa［19］。本研究中12個石油污染沉積物樣本中，細菌優勢群落均包括變形菌門γ-變形菌綱，如Psychrobacter sp.（條帶5）、Psychrobacter glacincola（條帶7）、uncultured Colwellia sp.（條帶8）、gamma proteobacterium（條帶15）；此外，本次調查海區大連灣沉積物中還出現了歸屬于變形菌門的δ-變形菌綱和ε-變形菌綱優勢種群。從系統發育分析樹（見圖4）可看出，本研究中出現了大量的擬桿菌門菌群（如條帶1、2、6、12、16），其中一些為以往報道過的石油烴降解菌，如擬桿菌門黃桿菌科的Flaviramulus和Algibacter lectus，這些細菌的存在為石油污染的降解起到了積極的作用［18］。擬桿菌門細菌是一類厭氧的滑動細菌，不需要鞭毛，通過分泌粘液（多糖）在平坦的表面滑動［21］。由此可見，本研究中變形菌門γ-變形菌綱和擬桿菌門在石油污染環境中的大量出現具有其合理性。我們推斷它們的滑動本領使其可以在粘稠的油污中自由穿行，同時它們又擁有很強的分泌胞外多糖能力，為滑動起到潤滑作用，使其能夠在惡劣的石油污染環境中存活。

4.2.2 厚壁菌門

本研究的3個站位都表現出以變形菌門和擬桿菌門為主，而厚壁菌門是在石油污染降低后才出現。余素林等［22］研究發現，黃河三角洲背景土壤中的微生物主要屬于γ-變形菌門的海桿菌Marinobacter與食烷菌Alcanivorax，添加原油至37.85 g／kg后，這兩個菌屬的豐度有所波動，最后均恢復背景水平；原油的添加對背景土壤中的α-變形菌門Alphaproteobacteria以及擬桿菌門Bacteroidetes微生物未產生顯著影響，但厚壁菌門只在背景土壤中出現（2.75%）。這與本研究的發現基本一致，說明變形菌門和擬桿菌門的細菌能夠耐受石油污染，而厚壁菌門不適應石油污染環境，原油對其具有抑制作用。

4.3 污染環境中的特殊細菌種群

在2001年，印度科研人員曾對阿根廷附近的亞南極水域的細菌多樣性調查，結果在受烴類污染物污染的水域中檢測到嗜冷菌屬Psychrobacter和弓形桿菌屬Arcobacter相關的克隆［23］。在大連灣DLW01站位沉積物樣品的細菌優勢種群中，變形菌門的γ-變形菌綱嗜冷桿菌（Psychrobacter sp.；條帶4、5、7）和ε-變形菌綱弓形桿菌屬（Arcobacter；條帶3）優勢度明顯，是以往石油污染研究中較少出現的特殊功能種群。

4.3.1 嗜冷桿菌屬

據歷史文獻記載，嗜冷菌是指在溫度低于0℃能緩慢生長，最適生長溫度低于15℃，高于20℃則不能生長的細菌［24］。近年來有關研究除了針對嗜冷菌的嗜冷性，還興起了嗜冷菌對污染物的敏感性研究。同濟大學基于Psychrobacter sp.的CellSense生物傳感器在重金屬、有機物、表面活性劑、抗生素等毒性檢測中應用的研究結果表明，Psychrobacter sp.具有較好的毒性響應特性［25—26］，這一發明為快速檢測石油污染的生理毒性提供了新方法，該菌有望成為檢測石油污染的指示生物。

4.3.2 弓形桿菌屬

弓形桿菌是一種人畜共患致病菌，該目標微生物已經被認為是歐洲和東南亞食源性相關疾病暴發的病因，美國農業部農業研究服務處的科學家對其做過重點研究，繪制了Arcobacter butzleri的宏基因組圖譜［27］，該類細菌在城市廢水、水產養殖廢水排放區域也有發現。吳春篤等［28］為掌握鎮江城市污水中微生物種群結構特征，通過構建并分析城市污水中細菌16S r RNA基因文庫發現：近似弓形桿菌屬的細菌比例高達74.2%，為城市污水中的主要優勢菌群，大連灣DLW01站位離岸較近，該區域可能受到陸源城市生活污水或養殖廢水的污染，弓形桿菌的檢出為城市污水處理和排放敲響了警鐘。

5 結論和展望

本研究將DGGE圖譜信息與目的條帶測序比對結果相結合，對石油污染和細菌群落變化之間的內在聯系進行了深入探討。在大連新港“7.16”輸油管道爆炸溢油事故發生后，大連灣表層沉積物中石油烴含量高的區域，細菌優勢種群較單一，反之則較豐富；海洋環境中同一區域的細菌群落能保持一定穩定性，變形菌門γ－變形菌綱和擬桿菌門一直保持優勢度較高，是石油生物降解過程中起重要作用的細菌菌群，而厚壁菌門只在石油烴含量低的區域出現；此外，出現的對污染物敏感的嗜冷桿菌可作為石油污染指示生物深入研究，具有致病性的弓形桿菌為城市污水處理和排放敲響了警鐘。

存在的問題及其展望：對細菌優勢種群的認識還不夠完全，大連灣石油污染環境中一定還存在許多細菌種群等待被分離研究；此外這些已經獲得的細菌優勢種群降解石油烴的機制值得在生理生化或遺傳特性等方面深入研究探討。

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Bacterial communities in Dalian Bay petroleum pollution sediments

Gao Xiaoyu1，2，3，Ming Hongxia1，2，Chen Jiaying1，2，3，Li Jiangyu1，2，3，Han Junli1，2，3，Lin Feng’ao1，2，Fan Jingfeng1，2
（1．National Marine Environmental Monitoring Center，State Oceanic Administration，Dalian 116023，China；2．Key Laboratory for Ecological Environment in Coastal Areas，State Oceanic Administration，Dalian 116023，China；3．College of Aquiculture andLife Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

In order to explore the connection between petroleum pollution and bacterial community structure change，the important dominant bacteria communities in the process of oil biodegradation，after the“7.16”pipeline explosion and oil spill accident happened in Dalian Xingang，the content of petroleum hydrocarbon and bacterial metagenome were studied in Dalian Bay.Results showed that the petroleum hydrocarbon content in the surface sediment of DLW01 in August 2010 was 1 492 mg／kg，according with the third standard of marine sediment quality.As time went on，the content of petroleum the presented basic downward thrend，and all conformed to the first standard of marine sediment quality in April 2011，July 2011，December 2011.16S rDNA targeted PCR－DGGE results suggested that the dominant bacteria communities were monotonous in high petroleum hydrocarbons areas，while conversely rich in low oil pollution.Bacterial community in the same place could maintain stability.Phylum Gammaproteobacteria and Bacteroidetes were higher in the oil polluted sediment of Dalian Bay，which played an important role in the process of oil biodegradation.Phylum Firmicutes only detected in the area of low oil pollution.The sensitive pollution indicator Psychrobacter sp.could be used as biological indicator for further research.

dominant bacterial communities；oil pollution；Dalian Bay；sediment

Q938.1

A

0253-4193（2014）06-0058-09

2013-06-27；

2013-11-27。

國家海洋局海洋溢油鑒別與損害評估技術重點實驗室開放研究基金（201103）。

高小玉（1987—），女，遼寧省大連市人，主要從事海洋環境中微生物的研究。E-mail：149786894＠qq.com

*通信作者：樊景鳳（1972—），女，黑龍江省明水縣人，研究員，博士，主要從事海洋微生物學與水產動物病害學研究。E-mail：jffan＠nmemc.gov.cn

高小玉，明紅霞，陳佳瑩，等.大連灣石油污染沉積物中細菌群落結構分析［J］.海洋學報，2014，36（6）：58—66，

10.3969／j. issn.0253-4193.2014.06.008

Gao Xiaoyu，Ming Hongxia，Chen Jiaying，et al.Bacterial communities in Dalian Bay petroleum pollution sediments［J］.Acta Oceanologica Sinica（in Chinese），2014，36（6）：58—66，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2014.06.008