在中醫院校研究生中開設“激光掃描共聚焦顯微術”的探索

尹素改 張穎 陳玉龍

【摘要】激光掃描共聚焦顯微術是目前最先進的分子細胞生物學研究技術之一，隨著激光掃描共聚焦顯微鏡性能的不斷提高，該技術在生物及醫學領域的應用越來越廣泛，并逐漸成為生物醫學實驗研究的必不可少的研究手段。醫學院校研究生作為集自然科學、生命科學、醫學科學和實驗技能為一身的高級專門人才，必須了解和掌握這一科研技術。

【關鍵詞】激光掃描共聚焦顯微術醫學院校探索

【課題項目】河南中醫學院苗圃工程項目：MP2012-02；教育部新世紀優秀人才支持項目, 項目編號為：NCET-11-0946。

【中圖分類號】G64 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-3089（2014）07-0249-01 激光掃描共聚焦顯微術 (Laser scanning confocal microscope，LSCM)是20世紀80年代中期發展起來并得到廣泛應用的新技術[1]，是在傳統光學顯微鏡的基礎上，結合激光、電子攝像和計算機圖像處理等現代高科技手段而形成的先進的細胞分子生物學分析技術。因其獨特的激光掃描裝置具有不損傷細胞、分辨率高、實現多重熒光共定位且能觀察樣品的三維圖像等優點，已被廣泛應用于形態學、細胞生物學、分子生物學、發育生物學、神經科學、藥理學、遺傳學和環境科學以及抗腫瘤藥物研究等領域[2]。在三年的教學實踐中，我們得到了以下幾點經驗:

一、教材編寫

激光掃描共聚焦顯微術作為一門實驗技術，必須以理論為基礎。但激光掃描共聚焦顯微術應用過于廣泛，開設的課時有限，加上目前沒有非常權威和經典的教材，所以要針對學生的情況和專業來精選授課內容，編寫教材，讓學生既能看懂，又能學以致用。

二、課前準備

首先，教師在上課前應做好充分準備。教師強烈的責任感和事業心及熟練的實驗技能，對學生起著潛移默化的作用。教師要做好課件，充分利用多媒體，在平時實驗時可以進行DV 拍攝，然后在課堂上觀看，結合理論知識進行總結、分析。要求學生課前預習，讓學生明確目的、要求及所需物品、器材等，“知其然，知其所以然”，這樣才能提高學生的實踐能力。另外，讓學生參與課前準備工作，可以在督促同學做好課前預習的同時，培養學生科學的實驗態度，增強其動手能力。

三、教學過程

1.加強“激光掃描共聚焦顯微術”基礎理論的講解：激光掃描共聚焦顯微鏡是采用激光作為光源，在傳統光學顯微鏡基礎上采用共聚焦原理和裝置，并利用計算機對所觀察的對象進行數字圖象處理的一套觀察、分析和輸出系統，相對比較復雜，單純的講述難以達到教學目的。在教學實踐中，儀器原理及應用介紹要緊密結合，對照儀器，現場講述，從原理到應用，從基礎研究到臨床研究，以學生熟悉的實驗為例子，既豐富了實驗內容，又加深了學生的理解，使理論介紹更加通俗易懂。

2.完善教師示教內容：教師不但要講樣品制作的一般流程和上機檢測的步驟，對于上機前樣品處理過程和一些需要注意的細節也要邊示范邊講解。例如用PI/annexin V-FITC法檢測貼壁細胞凋亡[3]，實際操作時，采用PI和Annexin V 分開染，即，PI先染，離心去掉染液后，再加結合液和Annexin V，10min 后上機檢測；而試劑盒說明書上是PI和Annexin V同時染。經過試驗比較，我們發現分開染可以減少實驗誤差，因為PI本身對細胞也是有毒性的。通過這樣的細節告訴學生: 實驗是一個非常嚴謹的實操過程，需要勤動手，愛動腦，任何一個小的細節都會對實驗結果產生影響。

同時一些操作細節也要告訴學生，比如：為控制其他因素對觀察結果的影響，不同樣品的片子之間保持激光電壓在掃描時相對穩定，激光電壓和增益一致以及掃描頭接收光波波譜范圍一致的前提下，掃描細胞多個斷層后得到的擴展焦點圖作為最終的圖形結果；為了減少因熒光淬滅或漂白帶來的影響，在成像之前接受可見光和激光照射的時間盡可能短而且相等；在實驗中所用的載玻片和蓋玻片盡可能薄，玻面光潔，厚度均勻，使用前應清潔液、乙醇液、蒸餾水泡洗，以消除雜質熒光；蓋玻片覆蓋標本后立即用無標本腐蝕作用的緩沖甘油封片，甘油要求沒有自發熒光。

3.在實驗中培養學生的科研精神：從檢測目的到熒光染料選擇、從數據獲取到結果分析，引導學生進行實驗步驟的設計。適當增加流式細胞術應用中的一些新技術新方法，提高學生的學習積極性和對科研的興趣。如細胞凋亡檢測，可以將學生分成兩組，第一組用PI/annexin V-FITC法，第二組用線粒體跨膜電位變化的檢測法。這兩種方法都能檢測細胞的早期凋亡，但效果是不同的。

4.及時小結，不斷提高: 實驗完成后，要求學生用理論知識解釋實驗結果，然后教師歸納總結，分析各組實驗過程中的經驗和不足，進一步鞏固激光掃描共聚焦顯微術的相關知識，加強記憶。這樣，使學生在取得豐富的感性認識的基礎上，透過現象看本質，從而將感性認識上升到理性認識。

在中醫藥領域中，激光掃描共聚焦術的應用日益廣泛 。所以我們在研究生中開設的這樣的課程，這是一個新的嘗試，學生反饋情況良好。在以后的教學中，我們將繼續探索好的教學方法，進一步提升實驗教學水平，促使學生在實驗中學會思考、主動分析、研究問題，更好地掌握專業知識和技術，為今后的職業發展奠定堅實的基礎。

參考文獻：

[1] White J.G. et al. Confocal microscopy comes of age [J]. Nature(London), 1987,328: 183-184.

[2] Brakenhoff G.T.et al.Three dimensional imaging in fluorescence by confocal scanning microscopy[J]. Micros,1989,153(2): 151-159.

[3] 王書奎，周振英．實用流式細胞術彩色圖譜[M].上海: 第二軍醫大學出版社，2004: 95-326．

[4] 代志軍，王西京，薛茜等．半枝蓮含藥血清對肝癌H22細胞凋亡及線粒體膜電位的影響[J].中西醫結合學報, 2008,6 ( 8 ) : 821-826.