利用TALENs和手工克隆技術高效獲得GHR基因敲除巴馬豬

李飛達，李勇，劉歡，張歡歡，劉楚新，張興舉，竇紅偉，楊文獻，杜玉濤

1. 深圳華大基因研究院，深圳 518083；

2. 深圳華大方舟生物技術有限公司，深圳 518083；

3. 深圳動物基因組輔助育種工程實驗室，深圳 518083

利用TALENs和手工克隆技術高效獲得GHR基因敲除巴馬豬

李飛達1,3，李勇1,2,3，劉歡1,3，張歡歡1,3，劉楚新1,3，張興舉1,3，竇紅偉2，楊文獻2，杜玉濤1,2,3

1. 深圳華大基因研究院，深圳 518083；

2. 深圳華大方舟生物技術有限公司，深圳 518083；

3. 深圳動物基因組輔助育種工程實驗室，深圳 518083

DNA編輯技術是基因靶向修飾技術的研究熱點，已廣泛應用于生物醫學和農業研究。然而，傳統基因打靶技術存在效率低、成本高、工作量大等缺點，其應用受到了極大的限制。文章利用最近發展起來的新型人工核酸酶——轉錄激活因子樣效應物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALENs)介導的基因組定點修飾技術，通過構建特異識別豬生長激素受體(GHR)基因的TALENs表達載體，共轉染巴馬胎豬成纖維細胞系，酶切鑒定G418抗性克隆細胞株的基因修飾效率為46.2%，其中2個為雙等位基因敲除的克隆細胞株。以雙等位基因敲除的克隆細胞株為核供體，利用手工克隆技術制備GHR-KO巴馬豬克隆胚，第6 d囊胚率為43.5%，654枚體外發育的囊胚移植6頭受體母豬，共獲得10頭存活的GHR-KO巴馬仔豬，其中7頭為雙等位基因敲除。體重檢測結果顯示，第 20周齡的 GHR-KO巴馬豬體重僅為對照巴馬豬的 50%。研究結果表明，TALENs和手工克隆技術能夠高效制備出基因敲除大動物。GHR-KO巴馬豬的成功制備為研究豬GHR基因生理功能以及人類侏儒癥分子機理提供了重要模型，也證明該技術比傳統基因打靶和克隆技術具備更簡捷、快速、高效，更易于在生物醫學和農業基因靶向修飾研究中推廣。……