腦損傷大鼠腦組織EB含量與Claudin-5表達的分析

張高煉 韋可聰 梁建平 謝偉星 朱云中 梁韡斌 周 慶 張曉寧 龔文勁（廣西中醫藥大學第一附屬醫院神經外科,廣西 南寧 530023）

腦損傷大鼠腦組織EB含量與Claudin-5表達的分析

張高煉 韋可聰 梁建平 謝偉星 朱云中 梁韡斌 周 慶 張曉寧 龔文勁（廣西中醫藥大學第一附屬醫院神經外科,廣西 南寧 530023）

目的研究黃芪對創傷性腦損傷后腦EB含量和緊密連接相關蛋白claudin-5表達的影響。方法采用自由落體致傷原理制成大鼠腦損傷模型，伊文思藍法檢測BBB通透性，Western blot法檢測Claudin-5的表達。結果腦損傷模型組及黃芪組BBB通透性于腦損傷后明顯增加，同時黃芪組BBB通透性低于腦損傷模型組；Claudin-5的表達在腦損傷模型組和黃芪組于傷后明顯減少，黃芪組的表達明顯高于腦損傷模型組（P＜0.01）。結論調節緊密連接相關蛋白Claudin-5的表達，進而調節BBB的通透性可能是黃芪抑制腦水腫形成的途徑之一。

腦水腫；黃芪；EB含量；Clandin-5

創傷性腦損傷簡稱TBI,作為臨床神經外科中較為常見的一種疾病,其致殘率、病死率極高,因此探尋TBI對人體產生的影響有重要意義。目前,臨床上對TBI的主要研究機體顱腦遭遇損傷后,其繼發性損傷機制的病理性表現。黃芪是我國中醫治療缺血性腦血管疾病時較為常用的一種中藥,其具備改善腦部血液微循環、增強抗自由基作用等藥理作用已經被現代藥理研究證實。而黃芪治療TBI臨床療效的相關研究文獻并不多見,同時藥理學關于其作用機制也尚未明確。本文旨在分析黃芪與claudin-5表達之間的關系,現將研究內容報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取

隨機挑選70只成年雄性SD大鼠,體質量均在200～260 g之間,選取大鼠均由廣西醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 材料型號

小鼠抗Claudin-5單克隆抗體由Santa Cruz公司生產；實驗中使用的戊巴比妥鈉由美國Sigma生產；另外伊文思藍由Evans blue,EB,Fluka公司進口分裝；山羊抗小鼠辣根過氧化物酶標記的IgG二抗由北京中山生物技術公司生產,黃芪注射液由黑龍江省珍寶島制藥有限公司。

1.3 研究方法

①對照研究:將由廣西醫科大學動物實驗中心提供的70只成年雄性SD大鼠,依據數字標記法隨機分成兩組,一組為對照組,另外一組為實驗組（黃芪組）,兩組均給予標準飼料喂養和自由飲水,保持室溫（20～25）°C及恒定的濕度。每組在隨機分為術后6 h、l d、3 d、5 d、7 d五個時相點,各時間點均取6只大鼠分別進行各項檢測。每組大鼠均在術后48 h內取樣腦組織,并均給予Claudin-5蛋白表達情況和BBB通透性等檢查。②大鼠腦部創傷處理:本文兩組大鼠制作的動物模型均參照Feeny等人制作大鼠創傷腦損傷模型方法對大鼠進行處理:依據自由落體的物理原理,制作相關大鼠腦部撞擊裝置。兩組大鼠均給予濃度為4%水合氯醛300 mg/kg進行腹腔麻醉；大鼠在實施麻醉后,將老鼠頭部放置在立體定向儀上,并做好固定處理；依據正中線將大鼠頭皮切開,并將其骨膜剝離,在前囟后3.5 mm進行標記,并使用牙科臺式電鉆進行處理,在中線右旁2.5 mm處鉆出圓形骨窗,骨窗直徑在5 mm左右,并避免對硬腦膜造成損傷；隨后讓骨窗處與撞擊器上的撞桿頭保持在同一水平線上,沿外用套管從15 cm高處放下40 g的擊錘并撞上擊桿,使得大鼠腦部右頂葉局部受到腦挫傷,隨后使用牙托粉將骨窗封閉,并縫合大鼠頭皮。黃芪組建模前每隔12 h腹腔注射黃芪2.5 g/kg（10 mL/kg）直到相應的時相點,對照組用相同劑量的生理鹽水,注射方式為腹腔注射。

1.4 觀察指標的測定

①測定EB含量:兩組大鼠在處死前1 h,均將濃度2%EB 3 mL/kg在大鼠股靜脈處注入；隨后采取斷頭取樣大鼠腦組織,并將取樣后的腦組織放置于培養皿中,避免水分流失；觀察大鼠中心腦組織損傷情況,并取樣損傷組織約100 mg,取樣承重后將其放置試管中保存,該試管預先注入劑量為3 mL的二甲基甲酰胺；隨后將試管放置于溫度為60 ℃水浴中,避光,并抽提24 h,離心處理10 min；量取上層離心液,并借助RF-540熒光分光光度計測定EB OD值（熒光光度值）,并選取蒸餾水作為空白對照；依據測定的光密度數值,聯系標準曲線對大鼠腦組織中的EB含量進行測定,并以EB含量水平（ug/g濕腦組織）來表現BBB通透性的變化。②大鼠腦組織中Claudin-5的表達:兩組大鼠均給予相應時間點大鼠麻醉處理,用生理鹽水及4多聚甲醛PBS經心臟灌注后斷頭取腦,于創傷灶邊緣取1 mm×1 mm×1 mm 大小的組織塊。并將其放置在濃度、成分均相同的固定液中；固定處理持續2～4 h,隨后將處理后的組織塊移人濃度為30%的蔗糖PBS緩沖液中,并置于溫度為4 ℃冰箱進行保存,直至沉底。沿大鼠創傷灶中心借助冷凍切片機進行連續冠狀冷凍切片處理。對每組大鼠采取一張腦切片一個指標的方式進行免疫組織化學分析,并借助200倍光學鏡隨機對選取創傷灶周邊5個相互毫無重疊視野進行觀察,每個時間點觀察視野共30個,記錄每個視野下該指標陽性細胞計數；其中Claudin-5表達蛋白采取1∶500倍進行稀釋,而B-actin抗體采取1:5000倍進行稀釋,并給予4 ℃孵育過夜處理；同時在二抗室溫持續孵育2 h；增強ECL發光（化學熒光反應）,并借助軟件Chemi Imager 5500V 2.03對膠片進行掃描,條帶積分光密度采取軟件Fluor Chem 2.0圖像分析儀進行定量分析。

1.5 統計學方法

上述大鼠數據均采取統計學軟件SPSS19.0進行分析和處理；數據以均數標準差表示,組間對比采用t檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 BBB通透性的變化情況

本文研究中借助EB滲透性實驗對兩組大鼠BBB通透性變化進行評估。各組腦組織EB含量于創傷性腦損傷后72 h時明顯升高；與對照組相比,黃芪組大鼠腦組織中EB含量水平明顯低于對照組大鼠腦組織EB含量,兩組間該項指標對比有統計學意義（P＜0.01）,詳細對比見表1。

2.2 腦組織claudin-5蛋白表達變化情況

兩組大鼠腦損傷后72 h,均發現Claudin-5蛋白表達含量水平明顯減少；黃芪組大鼠中claudin-5蛋白表達明顯高于對照組,兩組間該項指標對比差異有統計學意義（P＜0.01）,見表1。

表l 兩組大鼠ICH后腦組織EB含量及Claudin-5蛋白表達

表l 兩組大鼠ICH后腦組織EB含量及Claudin-5蛋白表達

3 討 論

外傷性急性彌漫性腦腫脹（posttraumatic acute diffuse brain swelling,PADBS）是當今顱腦損傷治療的難點,有報道其病死率達到65.0%～87.2%[1-2]。研究發現,腦外傷造成的血腦屏障（blood brain barrier,BBB）破壞是產生血管源性腦水腫的主要原因,創傷性腦損傷（TBI）后,其腦組織創傷會使得組織生理性代謝發生變化,進而產生一系列的病理變化,致使BBB的生理結構發生破壞,導致通透性異常增加,BBB結構的完整與否與腦水腫的形成密切相關[3]。

緊密連接由跨膜蛋白、胞質附著蛋白和細胞骨架蛋白Actin所組成,緊密連接將內皮細胞的腔面膜和腔對面膜分割開,起到柵欄作用；同時控制細胞旁途徑,起到閘門的作用；這也就是說BBB中最重要的結構為緊密連接。而病理學分析發現,Claudins（跨膜蛋白）作為緊密連接中復合物的重要構成成分之一,其參與緊密連接的細胞極化和選擇滲透性的維持中[4]。另外,Claudin-5作為大鼠機體腦部組織中調節腦血管內皮細胞膜通透性的主要調節因此,其對BBB通透性的變化和調節起著至關重要的作用[5]。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜英黃芪的干燥根,其主要成分為黃芪皂苷、黃芪多糖、氨基酸、微量元素（硒、錳、鐵、鋅、銅）和鈣等。有研究表明,黃芪皂苷甲能擴張血管,降低周圍血管阻力。從藥理學的角度證實黃芪具有補氣升陽、通經活絡、祛除癖滯的作用。黃芪注射液具有擴張血管、降低血壓、抗血小板凝集、改善微循環、拮抗氧自由基生成、消除過氧化脂質的作用等,從而保護組織細胞[6]。本研究發現,創傷性腦損傷后72 h,大鼠組織中BBB結構完整度被破壞,導致其通透性異常升高,而在黃芪的作用下,其創傷后腦組織后期的BBB通透性名相下降且明顯低于對照組大鼠；同時黃芪組大鼠中Claudin-5表達蛋白水平明顯高于對照組大鼠,這說明黃芪有助于TBI后期Claudin-5的表達,進而使得BBB的通透性得到調節,緩解TBI后期的的腦水腫程度。我們推測,黃芪可能通過改善顱腦損傷后腦微循環,清除氧自由基和阻滯神經細胞鈣超載,使緊密連接關閉,BBB通透性下降,而發揮減輕腦水腫的作用,其具體作用機制有待進一步研究。

[1] 王泓杰,劉興渡,王迅.黃芪對大鼠腦刨傷早期保護作用的實驗研究[J].中國當代醫生,2007,45(15):29-31.

[2] 廖圣芳,王漢東,陳漢民,等.亞低溫治療外傷性彌漫性腫脹的臨床研究[J].中國臨床醫學,2005,12(3):373-375。

[3] 李俊駒,王宇田,黃垂學,等.創傷性腦損傷后AQP4表達與血腦屏障通透性的關系[J].醫學臨床研究,2009,26(9):1633-1636。

[4] 楊智航,解輝,趙麗妮,等.大鼠創傷性腦損傷后Claudin-5表達水平變化的研究[J].中國當代醫藥,2011,18(36):25-27.

[5] 劉坤,姚陽.水蛭素對大鼠腦出血后血腦屏障通透性和緊密連接相關蛋白claudin-5表達的作用[J].沈陽醫學院學報,2011,13(3):137-139.

[6] 劉建新,王小亞,王曉峰,等.黃芪注射液對顱腦損傷后腦保護作用的實驗研究[J].中國中西醫結合急救雜志,2008,15(5):266-268.

R651.15

B

1671-8194（2014）25-0087-02

廣西教育廳立項項目（編號：201010LX261）