乙型肝炎肝DNA檢測的意義

吳平平

（內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院，內(nèi)蒙古 牙克石 022150）

乙型肝炎肝DNA檢測的意義

吳平平

（內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院，內(nèi)蒙古 牙克石 022150）

目的探討乙型肝炎肝DNA檢測對預(yù)測和評價(jià)治療效果的作用和意義。方法選取前來進(jìn)行乙型肝炎病毒檢測的門診患者85例，采集血清后進(jìn)行HBV-DNA定量檢測。結(jié)果ALT值與HBV-DNA拷貝數(shù)無明顯相關(guān)（P＞0.05），PCR測定可以檢測HBV-DNA含量。結(jié)論目前應(yīng)用PCR測定HBV-DNA能更早期、準(zhǔn)確和靈敏的反應(yīng)HBV在體內(nèi)的復(fù)制狀況，是判斷乙型肝炎病毒有無復(fù)制的指標(biāo)。HBVDNA陽性表示病毒在復(fù)制，定量檢測HBV-DNA可用于乙型肝炎的病因診斷，且可量化，作為臨床藥物，評價(jià)乙型肝炎治療效果及評估病原傳染性較為理想。

聚合酶鏈反應(yīng)；乙型肝炎DNA；檢測

乙型肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的世界性傳染病，我國是乙型肝炎高發(fā)區(qū)。乙肝可通過血液制品或體液傳播給其他人，臨床的常規(guī)檢測的方法主要是基于免疫學(xué)原理的“二對半”檢測，而“二對半”檢測無法精確反映病毒數(shù)量和病情的變化[1]。聚合酶鏈反應(yīng)檢測技術(shù)其靈敏度高，理論上，只要標(biāo)本中有一個(gè)分子的DNA就可以做出診斷[2]。在HBV感染的診斷中，在適合的條件下PCR的敏感性為100 copies/mL[3]。特異性強(qiáng)，對于一個(gè)20個(gè)核酸的引物來說，非特異性配對的概率為1/420[4]。其PCR可以克服血清學(xué)診斷有的交叉反應(yīng)的缺陷。為了解乙型肝炎病毒組織中HBV-DNA的含量變化，筆者采用定量聚合酶鏈反應(yīng)，對乙型肝炎患者進(jìn)行HBV-DNA含量檢測，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象：前來本院進(jìn)行乙型肝炎病毒檢測的門診患者。

1.2 研究方法：HBV-DNA定量檢測。采用定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測慢性乙型肝炎患者血清HBV-DNA含量。在臨床疾病的診斷和治療中，常常用到聚合酶鏈反應(yīng)測定方法，特別是對病毒性肝炎治療的動(dòng)態(tài)觀察。乙型肝炎病毒是是一種DNA病毒。此病毒顆粒分為包膜與核心兩部分，其中核心部分含有環(huán)狀雙股DNA、DNA聚合酶和核心抗原。HBV基因組又稱HBV-DNA，為環(huán)狀部分雙股DNA，分為長的負(fù)鏈L和短的正鏈S兩股。L鏈有4個(gè)開放讀碼區(qū)。分別為S、C、P、X區(qū)。S區(qū)分別編碼包膜上的前S1，前S2蛋白和HBsAg，三者合稱為大分子蛋白。C區(qū)編碼HBeAg和HBcAg。P區(qū)編碼一個(gè)堿性多肽，稱為DNA聚合酶（DANP），具有反轉(zhuǎn)錄酶活性。HBV病毒既可引起急性肝炎，也可引起慢性肝炎。目前的定量PCR方法分為三類，包括外標(biāo)方法、動(dòng)力學(xué)方法和內(nèi)標(biāo)共擴(kuò)增方法[4]。HBV-DNA檢測采用定量聚合酶鏈反應(yīng)。DNA變性是指雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，雙鏈解離，形成單鏈DNA。變性后，單鏈重新結(jié)合，形成雙鏈。第二步退火指模板DNA變性后分解，形成二條單鏈。系統(tǒng)溫度降低后，引物退火，與互補(bǔ)的DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。PCR可選擇性體外擴(kuò)增DNA片段。以20個(gè)核甙酸左右為宜，太短會出現(xiàn)錯(cuò)配，太長則易形成穩(wěn)定的集合體。最后是延伸，引物與模板結(jié)合后，在DNA多聚酶的作用下，從引物的5'端向3'端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。在熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)探針完整時(shí)，發(fā)射集團(tuán)受淬滅集團(tuán)抑制而不產(chǎn)生熒光；而在PCR復(fù)性階段，標(biāo)記探針因與靶基因互補(bǔ)；在PCR延伸期，在延伸達(dá)到探針結(jié)合部時(shí)將5'熒光發(fā)射集團(tuán)切下，淬滅作用解除；熒光強(qiáng)弱與PCR產(chǎn)物量成正比。在此檢測過程中必須進(jìn)行質(zhì)量控制，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR結(jié)束后，計(jì)算樣品中HBV-DNA的含量。在每次實(shí)驗(yàn)中，均設(shè)空白、陽性、陰性及峰值對照，每份標(biāo)本取兩孔均值對結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié) 果

血清中HBV-DNA的含量。見表1。

表1 患者血清中HBV-DNA含量

3 討 論

乙肝是乙型病毒性肝炎的簡稱，是以肝臟損害為主的傳染病。肝臟是我們身體中最重要的器官之一，通過醫(yī)學(xué)專家對大量臨床試驗(yàn)觀察研究，隨著年齡的增加，乙肝病毒攜帶者體內(nèi)的免疫功能從免疫耐受過度到免疫清除，引起肝細(xì)胞的免疫損傷，發(fā)生肝炎的臨床表現(xiàn)，部分患者容易發(fā)展為慢性肝炎和肝硬化，少數(shù)病例可轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟5]。所以此病對人類危害極大。乙型肝炎病毒其傳播途徑可因輸血、注射、創(chuàng)傷及母嬰傳播等方式感染。臨床上常用“二對半”進(jìn)行檢測，其檢測對象是由乙肝病毒感染后，存在于體內(nèi)的乙肝病毒表面抗原、表面抗體、e抗原、e抗體、核心抗體五項(xiàng)指標(biāo)來完成的[6]。但由于乙型肝炎病毒的變異、感染初期乙型肝炎病毒抗原的表達(dá)量很低、個(gè)體免疫力不同導(dǎo)致抗體表達(dá)量的差異、以及免疫檢測窗口期長等特點(diǎn)，導(dǎo)致“二對半”檢測結(jié)果與真實(shí)感染情況存在一定差異[7,8]。而乙肝病毒復(fù)制是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程，在肝功能的檢測中可以發(fā)現(xiàn)：ALT值與HBV-DNA的拷貝數(shù)之間無明顯的相關(guān)關(guān)系，其與乙型肝炎病毒含量水平無關(guān)。ALT值出現(xiàn)異常時(shí)，表明由于乙型肝炎病毒感染造成的肝細(xì)胞破損程度。而PCR測定可以檢測HBV-DNA含量，是反映病毒復(fù)制活動(dòng)最直接、可靠的指標(biāo)。

目前應(yīng)用PCR測定HBV-DNA能更早期、準(zhǔn)確和靈敏的反應(yīng)HBV在體內(nèi)的復(fù)制狀況，是判斷乙型肝炎病毒有無復(fù)制的指標(biāo)。HBVDNA陽性表示病毒在復(fù)制，定量檢測HBV-DNA可用于乙型肝炎的病因診斷，且可量化，作為臨床藥物，評價(jià)乙型肝炎治療效果及評估病原傳染性較為理想。血清中HBV-DNA含量與乙型肝炎的發(fā)展、治療、預(yù)后和轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切，研究其抗病毒基因表達(dá)作用，是探索和尋找更有效的乙型肝炎治療的新的靶點(diǎn)和新的治療方法，并從定性和定量角度探討它們的相互關(guān)系及其在診斷治療中的價(jià)值。

[1] 朱啟熔.重視乙型肝炎病毒母嬰垂直傳播的阻斷.中華肝臟病雜志,2003,11(4):199.

[2] 何敏,楊朝霞,劉微,等.HBV DNA定量檢測方法的評價(jià)[J].國外醫(yī)學(xué):生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊,2005,26(2):123-124.

[3 白艷麗,李建平,計(jì)玉仙.HBVDNA與HBVTRFIA檢測結(jié)果比較分析[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2004,19(5):43-44.

[4] 宋家武,林菊生,梁擴(kuò)素.HBx-GFP基因工程DN突變體瞬時(shí)表達(dá)抑制乙型肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華肝臟病學(xué)雜志,2003,11 (1):47-49.

[5] 王健,閔福援.乙肝病毒血清標(biāo)志物的檢測方法及其臨床意義[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2005,28(35):113-115.

[6] Poortahmasebi V,Alavian SM,Keyvani H,et al.Hepatic steatosis: prevalence and host/viral risk factors in Iranian patients with chronic hepatitis B infection [J].Asian Pac J Cancer Prev,2014, 15(9):3879-3884.

[7] Liu Y,Zeng P,Wang J,et al.Hepatitis B virus infection in a cohort of HIV infected blood donors and AIDS patients in Sichuan,China [J]. J Transl Med,2014,12(1):164.

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