電化學發光免疫分析法檢測維生素D試劑盒性能驗證

何國堅* 肖 慶 韋慶文

（深圳市龍崗中心醫院，廣東 深圳 518116）

電化學發光免疫分析法檢測維生素D試劑盒性能驗證

何國堅* 肖 慶 韋慶文

（深圳市龍崗中心醫院，廣東 深圳 518116）

目的在羅氏CS E170分析儀采用電化學發光免疫分析法檢測維生素D，評價其試劑盒性能指標。方法參考美國全國臨床和實驗室標準化協會（NCCLS）的EP系列文件，對電化學發光免疫分析法檢測維生素D試劑盒性能指標做出評估。結果電化學發光免疫分析法檢測維生素D有較好的穩定性，本實驗的檢出限為3.0 ng/mL；兩種不同濃度的定值質控血清在準確度評估中相對偏差（Bias%）均＜8%；三種不同濃度的臨床患者混合血清及兩種不同濃度的定值質控血清評估精密度批內、批間變異系數（CV%）均＜5%；在線性范圍評價中均為發現離群點，線性回歸方程為y=0.0181+0.988x，r=0.988。稀釋變異P為0.45（P0.05=0.6841），P＜0.05，稀釋變異可接受，線性失擬檢查G=3.22（F0.05=3.29），G＜ F0.05，線性良好；干擾試驗以相對偏差＜8%為醫學決定水平，T-Bil濃度≤360 μmol/L，Hb濃度≤4.0 g/L，維生素D測定相對偏差在可接受范圍；Hb濃度≥4.0 g/L，可引起維生素D測定結果升高，相對偏差尚在可接受范圍；Hb濃度≥9.0 g/L，引起維生素D測定結果升高超出可接受范圍。結論CS E170分析儀電化學發光免疫分析法檢測維生素D試劑盒穩定性、準確度、精密度、線性范圍、抗干擾能力均符合臨床檢驗要求。

維生素D；電化學發光免疫分析法；性能驗證

維生素D是一種脂溶性類固醇激素前體，主要由皮膚經光照后產生。維生素D本身無生物活性，必須在肝臟和腎臟相繼接受兩次羥基化才能生成具有生物活性1，25-羥基維生素D。 維生素D的兩種重要形式包括維生素D3（膽鈣化醇）和維生素D2（麥角鈣化醇）。與維生素D3不同，人體不能合成維生素D2，只能從強化食品或食品補充劑中獲取。

羅氏E170分析儀維生素D檢測利用維生素D結合蛋白 （VDBP）作為捕獲蛋白，結合維生素D3（25-OH）和維生素D2（25-OH）。EIecsys維生素D檢測具有高靈敏度，且所受影響因素較少，能自動化批量操作。我們在羅氏CS E170分析儀采用電化學發光免疫分析法檢測維生素D，參考美國全國臨床和實驗室標準化協會（NCCLS）的EP系列文件，對試劑盒性能指標做出評估，現分析如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑：羅氏CS 170E全自動分析儀，試劑及質控品為羅氏原廠試劑。R1為BPRu標記的維生素D結合蛋白；釕標記的維生素D結合蛋白；pH 7.5；R2為生物素標記的25-羥基維生素D；生物素化25-羥基維生素D；pH 8.6。試劑批號為174625。使用廠家提供標準品及質控品。質控1批號171270，靶值21.3 ng/mL；質控2批號170777，靶值43.6 ng/mL。

1.2 檢測原理：競爭法原理，總檢測時間：27 min；儀器自動通過2點校正的定標曲線計算得到檢測結果。

1.3 方法：參考NCCLS的EP系列文件，對試劑盒儲存穩定性、準確度、線性范圍及干擾實驗做出性能評估。

1.4 統計學分析：采用統計學軟件SPSS12.0及EXCEL軟件對數據進行分析處理。

2 結 果

2.1 穩定性：以蒸餾水代替樣本監測試劑空白吸光值（Abs1）評價試劑穩定性，連續測定1個月，試劑穩定，已超過說明書開封后放置在CS 170E上穩定28 d的指標。評價樣本穩定性采用選擇8份在試劑盒線性范圍內（3～70 ng/mL）不同濃度臨床樣本血清，注意排除溶血及黃疸標本，連續測定維生素D 2次取平均值，置于4 ℃保存4 d，解凍連續測定維生素D 2次取平均值，采用t檢驗比較各樣本2次均值差異，結果各樣本2次均值差異無統計學意義（P>0.05），具有較好的穩定性。

2.2 檢出限：以25次試劑空白均值+3S計算檢出限，本方法檢出限為≤2.0 μg/mL，根據說明書，低于檢出限報告維生素D≤3.0 μg/mL。

2.3 準確度：采用兩種不同濃度的定值質控血清各重復測定3次，計算各濃度均值（）及相對偏差（Bias%），以相對偏差＜8%為醫學決定水平，評價試劑盒準確度，結果見表1。

不同濃度兩種定值血清相對偏差均＜8%，試劑盒測試準確度評估合格。

2.4 精密度：以三種不同濃度的臨床患者混合血清及兩種不同濃度的定值質控血清為檢測對象，每日檢測2次（間隔時間>2 h），連續檢測10日，評價方法的批內及批間變異系數（CV%），結果見表2。

參照美國NCCLS機構EP文件要求，批內、批間不精密度均＜5%，試劑盒檢測精密度符合要求。

2.5 線性范圍評價：在試劑盒標定的線性范圍（3.00～70 ng/mL）取高濃度血清樣本（60.4 ng/mL）為5號樣本及低濃度樣本血清（4.12 ng/mL）為1號樣本，二者3∶1混合為2號樣本，等份混勻為3號，1∶3混合為4號，2～4號樣本濃度計算公式：標本濃度=（C1V1+C5V5）/（V1+V5），C為濃度，V為體積。隨機排列，每個標本測定4次，當天完成測定，離群點檢查P0.05=0.885，本組數據均為發現離群點，采用線性回歸分析，線性回歸方程為y=0.0181+0.988x，r=0.988，稀釋變異P為0.45（P0.05=0.6841），P＜0.05，稀釋變異可接受，線性失擬檢查G=3.22（F0.05=3.29），G＜ F0.05，線性良好。

2.6 干擾試驗：選取含總膽紅素（T-Bil）濃度360 μmol/L，血紅蛋白（Hb）濃度9 g/L的干擾物，將干擾物與臨床混合血清混合制成不同濃度血清干擾物混合物，檢測相對偏差，評價不同干擾物濃度對試劑盒檢測影響，結果見表3。

以相對偏差＜8%為醫學決定水平，T-Bil濃度≤360 μmol/L，Hb濃度≤4.0 g/L，維生素D相對偏差尚在可接受范圍。Hb濃度≥4.0 g/L引起維生素D測定結果升高，Hb濃度≥9.0 g/L引起維生素D測定結果升高超出可接受范圍。

表1 兩種不同濃度定值質控血清測定結果：（ng/L）

表2 臨床混合血清、定值質控血清重復性試驗標準差、變異系數結果

表3 干擾試劑盒實驗結果

3 討 論

維生素D是維持骨骼健康的主要元素。兒童期維生素D的嚴重缺乏將致骨骼畸形，即佝僂病。輕度缺乏將導致食物鈣的利用度下降[1]。維生素D缺乏將導致肌肉乏力；對于中老年人，維生素D對肌肉功能的影響還將增加跌倒風險[2]。維生素D缺乏是導致繼發性甲狀旁腺功能亢進癥的主要原因。PTH水平升高，特別是對于中老年維生素D缺乏人群，可導致骨軟化癥，骨轉換增加，骨量減少，骨折風險增加。維生素D（25-OH）濃度降低與骨密度降低有關。 結合其他臨床資料，檢測結果有助于評估骨代謝情況。到目前為止，已發現維生素D可影響200多種不同基因的表達。維生素D缺乏與糖尿病、不同種類的癌癥、心血管疾病、自身免疫性疾病和先天性免疫疾病有關[3]。

血清25-OHD測定是衡量VD營養狀態的最佳指標，由于25-OHD的測定結果直接影響對VD營養狀況的判斷，測定結果準確與否、不同的測定方法之間是否一致，至關重要。現有多種方法用于臨床25-OHD的測定，根據方法原理，可分為免疫分析法和色譜法。免疫分析法只能測定25-OHD總量，無法同時測定25-OHD2和25-OHD3的濃度。現有色譜法可區分并能分別定量25-OHD2和25-OHD3。免疫分析法是早期VD測定的主流方法。

目前常用方法有：①放射免疫法（RIA），靈敏度高、特異性強、精密度好，儀器設備條件要求不高，是基層單位對超微量物質測定的主要手段，但存在放射污染的潛在風險。②酶聯免疫吸附法（ELISA）：設備和操作簡單，無污染，但敏感性和特異性較差。③化學發光免疫測定法（CLIA）：具有操作簡單、快速、無同位素污染等優點，容易自動化，適合在臨床實驗室常規開展。Leino等分析比較了羅氏E170電化學發光免疫分析儀與RIA、HPLC、LC-MS/MS檢測25-OHD3結果的符合性，發現ECLIA法與LC-MS/MS、RIA檢測結果的一致性較好[4-6]。

HPLC是早期應用較多的色譜法之一，靈敏度、特異性、準確性都較高，但設備較貴，標本前處理過程復雜。操作程序較復雜，需要更昂貴的特殊儀器，不適合臨床常規開展。

由于檢測方法學的局限，目前尚無血清25-OHD的統一標準。為保證檢測方法的準確性及穩定性，我們對羅氏E170電化學發光免疫分析系統檢測血清維生素D試劑盒進行評估。評估結果表明：電化學發光免疫分析法檢測維生素D的檢出限為3.0 ng/mL；兩種不同濃度的定值質控血清在準確度評估中相對偏差（Bias%）均＜8%；三種不同濃度的臨床患者混合血清及兩種不同濃度的定值質控血清評估精密度批內、批間變異系數（CV%）均＜5%；在線性范圍評價中均為發現離群點，線性回歸方程為y=0.0181+0.988x，r=0.988。稀釋變異P為0.45（P0.05=0.6841），P＜0.05，稀釋變異可接受，線性失擬檢查G=3.22（F0.05=3.29），G＜ F0.05，線性良好；干擾試驗以相對偏差＜8%為醫學決定水平，T-Bil濃度≤360 μmol/L，Hb濃度≤4.0 g/L，維生素D測定相對偏差在可接受范圍；Hb濃度≥4.0 g/L，可引起維生素D測定結果升高，相對偏差尚在可接受范圍；Hb濃度≥9.0 g/L，引起維生素D測定結果升高超出可接受范圍。CS E170分析儀電化學發光免疫分析法檢測維生素D試劑盒穩定性、準確度、精密度、線性范圍、抗干擾能力均符合臨床檢驗要求。

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[4] 楊有業,張秀明.臨床檢驗方法學評價[M].北京:人民衛生出版社,2008.

[5] 陳益明,褚雪蓮,王忠平,等.電化學發光免疫分析法檢測嬰幼兒血清 25-羥基維生素 D3參考區間的調查[J].現代預防醫學, 2014,41(3):389-392.

[6] 李波,譚祥權,羅佳美,等.萬州區兒童維生素D營養狀況及其與身高發育的關系研究[J].重慶醫學,2013,42(33):4070-4072.

R392

B

1671-8194（2014）23-0076-02

深圳市龍崗區科創委課題，編號LG20140519093453

*通訊作者：E-mail:583030063@qq.com