國產替米沙坦分散片與進口替米沙坦片在健康志愿者中的生物等效性研究

肖亞寶楊海淼宋冬梅

（1 浙江泰利森藥業有限公司，浙江 嘉興314300；2 長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春130103；3 沈陽億靈醫藥科技有限公司，遼寧 沈陽110179）

國產替米沙坦分散片與進口替米沙坦片在健康志愿者中的生物等效性研究

肖亞寶1楊海淼2宋冬梅3

（1 浙江泰利森藥業有限公司，浙江 嘉興314300；2 長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春130103；3 沈陽億靈醫藥科技有限公司，遼寧 沈陽110179）

目的在24名男性健康受試者中比較國產替米沙坦分散片與原研進口替米沙坦片的生物等效性。方法篩選24名健康男性志愿者，采用隨機交叉試驗設計，應用高效液相色譜-熒光檢測法測定血漿中替米沙坦的濃度，根據測定結果計算主要藥動學參數，并以進口替米沙坦片為參比制劑，評估替米沙坦分散片的生物等效性。結果經DAS2.1.1數據統計軟件計算藥動學參數，受試制劑A的t1/2：（27.94±9.94）h、Cmax：（757.9±238.3）ng/mL、Tmax：（1.18±0.49）h、AUC0-t：（4423±2645）ng/（h·mL）、AUC0-∞：（4804±3146）ng/（h·mL）；受試制劑B的t1/2：（25.58±8.56）h、Cmax：（763.4±283.3）ng/mL、Tmax：（1.22±0.52）h、AUC0-t：（4195 ±1988）ng/（h·mL）、AUC0-∞：（4437±2122）ng/（h·mL）；參比制劑的t1/2：（28.98±11.66）h、Cmax：（755.6±268.2）ng/mL、Tmax：（1.15±0.51）h、AUC0-t：（4327±2039）ng/（h·mL）、AUC0-∞：（4622±2201）ng/（h·mL）。以AUC0-t計算，與參比制劑相比受試制劑A、受試制劑B中替米沙坦的相對生物利用度分別為（99.2±26.8）%、（98.3±26.4）%。結論國產替米沙坦分散片與原研進口替米沙坦片具有生物等效性。

替米沙坦；生物等效性；高效液相色譜法

替米沙坦為德國Boehringer Ingelheim制藥公司研制開發的特異性的非肽類血管緊張素Ⅱ受體（AT1亞型）拮抗劑。臨床上主要用于治療原發性高血壓。本品與AT1亞型有高親和力，通過選擇性抑制血管緊張素Ⅱ與AT1受體結合，并降低血醛固酮水平，從而產生降壓作用。目前已在國內外上市使用。本試驗采用乙醚-二氯甲烷為提取溶劑，通過酸化處理方法進行血漿樣品的提取，建立高效液相色譜-熒光檢測法測定血漿中替米沙坦藥物濃度，并以進口替米沙坦片（商品名：美卡素）作參比制劑，比較國產替米沙坦分散片與進口替米沙坦片的生物等效性。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

受試制劑A：替米沙坦分散片，40毫克/片，批號：081101；受試制劑B：替米沙坦分散片，80毫克/片，批號：081102；受試制劑A、B均由浙江泰利森藥業有限公司生產；參比制劑：替米沙坦片，80毫克/片，批號：804188，Boehringer Ingelheim International GmbH生產、上海勃林格殷格翰藥業有限公司分裝；替米沙坦對照品（批號：080901；浙江省食品藥品檢驗所標定），內標（坎地沙坦，批號：20090601；威海迪素制藥有限公司），甲醇、乙腈均為色譜純（山東禹王實業有限公司化工分公司），水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

LC-10ATvp型高效液相色譜儀，Agilent熒光檢測器，Agilent ChemStation for LC工作站。FA1004電子天平（上海恒平科學儀器有限公司），XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），MTN-2800W氮吹濃縮裝置（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 受試者

獲醫學倫理委員會審批同意，24名健康男性志愿受試者，年齡18～40歲，體質量指數（BMI）在19～24，無心、肝、肺、腎、消化道、神經系統、精神異常及代謝異常等疾病，經體格檢查血壓、心電圖、呼吸狀況及肝、腎功能、血象均無異常，試驗前2周內未服過任何藥物，自愿參加試驗并于試驗前簽署知情同意書。

1.3.2 標本采集

圖1 空白血漿

圖2 替米沙坦＋內標

受試者于試驗前1 d吃清淡晚餐后過夜（禁食10 h后），于次日早7時在室溫條件下空腹將2片(40毫克/片)受試制劑A或1片（80毫克/片）受試制劑B或1片（80毫克/片）參比制劑（藥物總劑量80毫克）用250 mL溫開水送服。14 d后交叉服藥。分別于給藥前及給藥后0.167、0.333、0.667、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48、72、96 h由靜脈采血5 mL。3500 rpm離心10 min，分離血漿，分離出的血漿樣本于-70 ℃保存至分析（注意以上過程需避光操作）。

1.4 血藥濃度測定

1.4.1 色譜條件

色譜柱（Diamonsil C18柱，200 mm×4.6 mm，5 μm），預柱（琛航C18保護柱），流動相為0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（pH 3.13± 0.02）-乙腈（57∶43），熒光激發波長（Excitation）300 nm，熒光發射波長（Emission），385 nm；流速：1.2 mL/min；進樣量：50 μL；柱溫：30 ℃。

1.4.2 樣品處理

將解凍后血漿樣品渦旋30 s，精密量取血漿500 μL，置于5 mL離心管中，依次加入甲醇-水（1∶1）50 μL，坎地沙坦內標溶液50 μL，10%的磷酸溶液100 μL，再加入乙醚-二氯甲烷（3∶2）3 mL，渦旋混勻30 s，振蕩10 min，離心5 min（15000 rpm），移取有機相于另一5 mL離心管中，40 ℃水浴空氣流下吹干。殘留物用200 μL流動相復溶，渦旋混勻30 s，轉移溶液于另一1.5 mL離心管中，離心5 min（15000 rpm），取上清液50 μL進樣分析（以上均避光操作）。

1.5 方法學考察

1.5.1 標準曲線的制備

于空白血漿中加入不同量的替米沙坦標準溶液，配制成血漿中替米沙坦濃度為2.1、4.1、10.2、51.2、204.8、819.2、1228.8 ng/mL的樣品，按“血漿樣品處理方法”項下自加入“坎地沙坦內標溶液50 μL”起同法試驗，每一濃度進行雙樣本分析，制備替米沙坦的標準曲線。以待測物濃度為橫坐標X，待測物與內標物的峰面積比值（AS/Ai）為縱坐標Y，用加權最小二乘法[2]（權重系數：1/χ2）進行線性回歸運算，求得的線性回歸方程即為標準曲線方程。

1.5.2 準確度與精密度試驗

在空白血漿中分別加入不同量的替米沙坦標準溶液，配制成血漿中替米沙坦濃度為5.1、81.9和1024.0 ng/mL的血漿樣品（每濃度六樣本分析），按“血漿樣品處理方法”項下自加入“坎地沙坦內標溶液50 μL”起同法試驗，連續測定三批（與標準曲線的測定同時進行），計算血漿樣品的濃度，求得方法的精密度與準確度。

1.5.3 穩定性考察

配制低、高（5.1、1024.0 ng/mL）2個濃度的血漿樣品（每濃度三樣本分析），考察血漿樣品冷凍-解凍3個周期后的穩定性、長期冷凍條件下血漿樣品的穩定性。

1.6 回收率

配制低、中、高（5.1、81.9和1024.0 ng/mL）3個濃度的替米沙坦血漿樣品（每濃度六樣本分析），按“血漿樣品處理方法”項下自加入“坎地沙坦內標溶液50 μL”起同法試驗，獲得相應色譜峰面積；另取對應濃度的替米沙坦標準溶液50 μL，加入坎地沙坦內標溶液50 μL，流動相100 μL（每濃度六樣本分析），渦旋混合30 s，取50 μL進樣分析，獲得相應色譜峰面積（6次測定的平均值）。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算提取回收率。

圖3 受試制劑A血漿樣品色譜圖

圖4 受試制劑B血漿樣品色譜圖

1.7 質量控制

為減少系統誤差，每批樣品分析時，建立隨行標準曲線計算血藥濃度，隨行標準曲線用加權最小二乘法[2]（W=1/χ2）進行線性回歸運算，同時平行測定低、中、高三個濃度（替米沙坦第一分析批：5.1、81.9、1024.0 ng/mL；第二～四分析批：5.1、80.7、1009.0 ng/mL；第五～七分析批：5.0、79.2、990.0 ng/mL）的質控樣品，質控樣品測定結果的RE應在±15%之內，最多允許33%不在同一濃度的質控樣品結果超限，當批數據方可接受。

1.8 數據處理

采用DAS 2.1.1數據統計軟件將相關藥動學參數（Cmax、AUC0-t、AUC0-∞）進行對數轉換以評價受試者分別服用參比制劑和受試制劑后的藥動學參數及相對生物利用度。Tmax宜采用非參數檢驗法的秩和檢驗判定兩制劑是否具有顯著性差異。生物等效性評價是通過計算受試制劑和參比制劑Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的對數比值的（取對數后）90%置信區間進行的。AUC的對數比值的90%置信區間在80%～125%，Cmax對數比值的90%置信區間在75%～ 133%，則可判定受試制劑A和受試制劑B分別與參比制劑具有生物等效性。

2 結 果

2.1 方法特異性及色譜行為

圖1～圖4分別為空白血漿、空白血漿加替米沙坦標準溶液和內標溶液、受試制劑A血漿樣品、受試制劑B血漿樣品色譜圖。

上述色譜圖結果表明，坎地沙坦保留時間為6.8 min左右，替米沙坦的保留時間為10.7 min左右，血漿中內源性物質不干擾替米沙坦和內標物坎地沙坦的測定。

2.2 標準曲線和最低定量限

以血漿中替米沙坦濃度對替米沙坦與坎地沙坦的峰面積比值（AS/ Ai）進行線性回歸。結果表明，替米沙坦在2.1～1228.8 ng/mL范圍內與待測物和內標物峰面積之比線性關系良好，回歸方程及相關系數分別為：Y=0.00202+0.02496×X，R=0.9999（n=7），本試驗建立的高效液相色譜法測定血漿中替米沙坦濃度的定量下限為2.1 ng/mL。

2.3 方法精密度與準確度

本試驗所建立的高效液相色譜法測定的準確度和批內、批間精密度均達到試驗要求[1]。見表1。

2.4 回收率

低、中、高濃度（5.1、81.9、1024.0 ng/mL）的血漿樣品提取回收率分別為75.0%、74.1%和77.3%，RSD（%）分別為4.9%、0.7%和3.2%（n=6）。

2.5 穩定性及質量控制

結果表明，替米沙坦血漿樣品經過3次冷凍—解凍循環后穩定，在-20 ℃保存94 d內穩定。見表2。

為減少系統誤差，每批血漿樣品分析時，建立隨行標準曲線計算血藥濃度，隨行標準曲線用加權最小二乘法[2]（W=1/χ2）進行線性回歸運算，同時平行測定低、中、高3個濃度的質控樣品，質控樣品測定結果的RE均在±15%之內，符合有關規定[1]。

2.6 藥動學參數及結果

24名健康受試者分別口服替米沙坦分散片受試制劑A、受試制劑B和替米沙坦片參比制劑后藥-時曲線見圖5。主要藥動學參數以及生物利用度結果見表3。

表1 替米沙坦精密度與準確度

表2 替米沙坦血漿樣品3次冷凍解凍循環穩定性

表3 受試制劑A、B和參比制劑主要藥動學參數

2.7 生物等效性結果

方差分析結果顯示，AUC0-t、AUC0-∞和Cmax在藥劑間、周期間的差異均無統計學意義（P＞0.05），但是在個體間的差異有統計學意義（P＜0.05）。采用雙單側t檢驗和[1-2α]置信區間法進行生物等效性評價，其中Tmax采用非參數檢驗法。結果表明，替米沙坦分散片受試制劑A、受試制劑B的AUC0-t、AUC0-∞和Cmax均拒絕生物不等效假設。受試制劑A中，替米沙坦AUC0-t的90%置信區間為參比制劑的87.8%～105.1%，AUC0-∞的90%置信區間為參比制劑的87.7%～105.3%，Cmax的90%置信區間為參比制劑的92.5%～110.0%。受試制劑B中，替米沙坦AUC0-t的90%置信區間為參比制劑86.9%～104.1%，AUC0-∞的90%置信區間為參比制劑的85.6%～102.8%，Cmax的90%置信區間為參比制劑的91.1%～108.3%。Tmax在受試制劑A、受試制劑B與參比制劑間的Tmax均無顯著性差異。

根據以上結果判定，浙江泰利森藥業有限公司提供的國產替米沙坦分散片（受試制劑A，規格：40毫克/片和受試制劑B，規格：80毫克/片）與Boehringer Ingelheim International GmbH生產、上海勃林格殷格翰藥業有限公司分裝的原研藥品替米沙坦片（參比制劑，商品名：美卡素?，規格：80毫克/片）具有生物等效性。

3 討 論

[3]，首先選擇乙腈直接沉淀蛋白的樣品處理方法，結果表明雜質干擾較多。替米沙坦血漿蛋白結合率較高，為99%以上，故采用酸化后用提取溶劑進行提取的樣品處理方法。考察了乙醚-二氯甲烷（3∶2）和乙酸乙酯作為提取溶劑，結果表明乙醚-二氯甲烷（3∶2）提取率較高，干擾較小，故選擇其為提取溶劑。

本試驗所建立的高效液相色譜法測定人體血漿中替米沙坦的濃度，具有分析時間短、操作簡便、靈敏度高等特點，適用于替米沙坦分散片的人體生物等效性研究。

本試驗采用DAS2.1.1數據統計軟件，對藥動學參數進行計算，結果表明受試制劑與參比制劑的藥動學參數與文獻[3]報道基本一致。同時文獻報道，Cmax、AUC個體間差異較大，本試驗結果與報道基本一致。

對替米沙坦的主要藥動學參數進行方差分析表明，兩制劑的Cmax、AUC經對數轉換后，在制劑間、周期間均無顯著性差異，兩制劑具有生物等效性。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗指導原則(中華人民共和國藥典二部2010年版)[M].北京:化學工業出版社,2010:195-199.

[2] 鐘大放.以加權最小二乘法建立生物分析標準曲線的若干問題[J].藥物分析雜志,1996,1(5):343-346.

[3] 喬海靈,田鑫,溫強,等.替米沙坦片在健康人體的藥代動力學和相對生物利用度[J].中國臨床藥理學雜志,2005,21(1):33-36.

R969.1

B

1671-8194（2014）21-0094-03