粒細(xì)胞集落刺激因子治療凍融胚胎移植周期薄型子宮內(nèi)膜的研究

李予，潘萍，2，陳曉莉，李琳，李軼，楊冬梓＊

（1．中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院生殖中心，廣州 510120；2．廣東省計(jì)劃生育專科醫(yī)院生殖科，廣州 510600）

在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域，薄型子宮內(nèi)膜的治療一直是一個(gè)非常棘手的難題，子宮內(nèi)膜菲薄的不孕患者助孕效果欠佳，妊娠幾率降低［1－3］。迄今為止，薄型子宮內(nèi)膜無(wú)公認(rèn)最有效的治療方法，生殖醫(yī)學(xué)工作者探索了各種各樣的方法，包括大劑量雌激素、低劑量阿司匹林、陰道用西地那非、己酮可可堿、維生素E和促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑等，但療效報(bào)道不一［4－8］。

2011年Gleicher等［9］首次報(bào)道應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）治療薄型子宮內(nèi)膜獲得較好結(jié)果，但細(xì)胞因子作為一種治療薄型子宮內(nèi)膜的新方法，其有效性尚有待更多的臨床研究。因此，本研究在凍融胚胎移植（FET）周期對(duì)子宮內(nèi)膜菲薄的患者宮腔灌注G-CSF，旨在探討G-CSF對(duì)治療結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對(duì)象和FET內(nèi)膜準(zhǔn)備方案

選擇2011年8月至2012年12月在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院生殖中心行FET治療且排卵日或黃體酮／HCG注射日最大子宮內(nèi)膜厚度≤7mm的69例患者進(jìn)入本研究。FET內(nèi)膜準(zhǔn)備方案包括自然周期、激素替代周期和誘發(fā)排卵周期，根據(jù)患者排卵和內(nèi)膜的生長(zhǎng)情況進(jìn)行方案選擇：對(duì)于月經(jīng)規(guī)律、排卵正常者，首選自然周期；若內(nèi)膜生長(zhǎng)不良，下周期改用激素替代周期，如果仍然發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜過(guò)薄，最后選擇誘發(fā)排卵周期；對(duì)于月經(jīng)不規(guī)則、排卵障礙者，首選激素替代周期，若內(nèi)膜生長(zhǎng)不良，誘發(fā)排卵周期作為二線治療。低劑量阿司匹林和維生素E是內(nèi)膜菲薄患者的常規(guī)輔助用藥，個(gè)別患者陰道用西地那非。

二、內(nèi)膜監(jiān)測(cè)

對(duì)于自然周期行FET的不孕患者，根據(jù)月經(jīng)周期情況，在預(yù)計(jì)排卵前2～5d進(jìn)行連續(xù)的陰道超聲檢查和尿黃體生成素（LH）監(jiān)測(cè)，直至卵泡成熟和排卵。對(duì)于激素替代周期行FET者，從月經(jīng)來(lái)潮第3天起口服補(bǔ)佳樂(lè)（廣州拜耳醫(yī)藥）2mg／d，超聲監(jiān)測(cè)內(nèi)膜厚度，根據(jù)內(nèi)膜反應(yīng)每4d逐漸遞增藥物劑量，直至最大劑量12mg／d；對(duì)于誘發(fā)排卵周期行FET者，從月經(jīng)來(lái)潮第3天起口服他莫昔芬（上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)）20mg／d，連用5d，后續(xù)聯(lián)合應(yīng)用人絕經(jīng)期促性腺激素（HMG，珠海麗珠制藥）75IU／d。超聲監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育和內(nèi)膜厚度，適時(shí)應(yīng)用HCG刺激排卵。

超聲下內(nèi)膜厚度的測(cè)量：在子宮正中矢狀面內(nèi)膜強(qiáng)回聲與肌層交界處測(cè)得最大前后徑，當(dāng)內(nèi)膜厚度≤7mm時(shí)，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。若在自然周期排卵日、或激素替代周期黃體酮注射日、或誘發(fā)排卵周期HCG注射日內(nèi)膜厚度≤7mm，則診斷為薄型子宮內(nèi)膜。

三、宮腔灌注G-CSF

對(duì)于內(nèi)膜厚度≤7mm的患者，給予以下建議：（1）取消本周期，下周期調(diào)整內(nèi)膜準(zhǔn)備方案；（2）繼續(xù)胚胎移植。對(duì)于堅(jiān)持要求胚胎移植者，建議其應(yīng)用G-CSF治療，但患者的選擇不影響其后續(xù)治療方案。其中，41例選擇了G-CSF治療并簽署書(shū)面的知情同意書(shū)，在排卵日或黃體酮／HCG注射日宮腔灌注100μg（0．6mL）的人重組 G-CSF（商品名瑞白TM，山東齊魯制藥），28例不接受G-CSF治療。

宮腔灌注G-CSF方法：常規(guī)外陰陰道消毒后，用1mL注射器連接COOK一次性人工授精管，抽吸0．6mLG-CSF，并將其緩慢注入宮腔。

所有患者常規(guī)應(yīng)用黃體酮（廣州白云山明興制藥）40mg／d轉(zhuǎn)化子宮內(nèi)膜，3～5d后移植凍融胚胎。

四、分組及觀察指標(biāo)

主要觀察指標(biāo)是每個(gè)移植周期的胚胎種植率和臨床妊娠率。考慮到患者年齡和胚胎質(zhì)量對(duì)種植率和妊娠率的影響，年齡＞40歲或無(wú)優(yōu)質(zhì)胚胎移植者不納入最后的統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)Istanbul的胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［11］，評(píng)分1級(jí)的卵裂期胚胎和評(píng)分3級(jí)或5級(jí)的D5囊胚視為優(yōu)質(zhì)胚胎。因此，10例患者未納入分析，其中7例進(jìn)行了G-CSF治療，3例未進(jìn)行。在納入最后分析的59例患者中，34例進(jìn)行了G-CSF治療，其中40個(gè)應(yīng)用G-CSF治療的周期作為G-CSF組，49個(gè)既往周期作為自身對(duì)照組，同期25例未應(yīng)用G-CSF治療的80個(gè)周期作為對(duì)照組。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P值＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基本臨床資料

所有患者的臨床資料總結(jié)詳見(jiàn)表1。年齡、孕次、不孕類型、不孕年限、體重指數(shù)（BMI）、激素水平、新鮮IVF周期數(shù)、新鮮IVF周期內(nèi)膜厚度、新鮮IVF周期薄型子宮內(nèi)膜的比例以及不孕因素等在應(yīng)用G-CSF治療和未應(yīng)用G-CSF的患者之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。11例患者新鮮IVF周期內(nèi)膜厚度正常，但新鮮周期助孕后發(fā)生了流產(chǎn)。在FET周期7例應(yīng)用G-CSF治療，4例未應(yīng)用。

二、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案和治療結(jié)局比較

誘發(fā)排卵周期和自然周期所占比例在G-CSF組分別為30．00%和12．50%，自身對(duì)照組分別為8．16% 和 28．57%，對(duì) 照 組 分 別 為 16．25% 和33．75%。與自身對(duì)照組或?qū)φ战M相比，G-CSF組誘發(fā)排卵周期比例高，自然周期比例低，有顯著差異（P＜0．05）；而自身對(duì)照組和對(duì)照組的內(nèi)膜準(zhǔn)備方案無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0．255）。三組患者周期取消率依次為：自身對(duì)照組69．39%，對(duì)照組48．75%，G-CSF組17．50%，有顯著差異（P＜0．05）（表2）。

表1 患者基本臨床資料［（±s），n（%）］

表1 患者基本臨床資料［（±s），n（%）］

組 別 n 年齡（歲） 孕次 原發(fā) 繼發(fā) 不孕年限（年） BMI（kg／m2不孕類型）4．26±2．91 20．83±2．88無(wú) G-CSF治療 25 31．96±3．65 1．16±1．07 8（32．00） 17（68．00） 5．72±4．02 20．95±2．91 G-CSF治療 34 30．91±3．51 1．21±1．23 11（32．35） 23（67．65）薄型內(nèi)膜G-CSF治療 34 7．83±2．25 5．96±4．72 196．79±174．03 1．44±0．82 7．77±1．61 21（42．86）組 別 n 基礎(chǔ)FSH（U／L）基礎(chǔ)LH（U／L）基礎(chǔ)E2（pmol／L）新鮮IVF周期周期數(shù)（n）內(nèi)膜厚度（mm）無(wú) G-CSF治療 25 7．10±1．44 6．43±4．12 162．03±71．97 1．40±0．71 7．78±1．46 18（51．43）組 別 n不孕因素盆腔／輸卵管異位癥G-CSF治療 34 27（79．41） 19（55．88） 8（23．53） 7（20．59） 1（2．94） 1（2．94）因素 男方因素 宮腔因素 多囊卵巢綜合征 不明原因 子宮內(nèi)膜無(wú) G-CSF治療 25 17（68．00） 18（72．00） 10（40．00） 6（24．00） 1（4．00） 1（4．00）

表2 各組FET周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案和治療結(jié)局［（±s），n（%）］

表2 各組FET周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案和治療結(jié)局［（±s），n（%）］

注：D0＝排卵日或黃體酮／HCG注射日；D3＝排卵或黃體酮／HCG注射后72h；D5＝排卵或黃體酮／HCG注射后120h；與G-CSF組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．001；與自身對(duì)照組相比，＃P＜0．05

治療方案組 別 n自然周期 激素替代周期 誘發(fā)排卵周期D0內(nèi)膜厚度（mm）取消周期（%）完成周期數(shù)（n）移植胚胎數(shù)（n）6．51±0．69 17．50 33 2．48±0．57自身對(duì)照組 49 14（28．57）＊ 31（63．27）＊ 4（8．16）＊ 6．26±1．41 69．39＊＊ 15 2．53±0．52對(duì)照組 80 27（33．75）＊ 40（50．00）＊ 13（16．25）＊ 6．42±0．91 48．75＊＃ 41 2．56±0．55 G-CSF組 40 5（12．50） 23（57．50） 12（30．00）組 別 n 復(fù)蘇率（%） 胚胎種植／ET 臨床妊娠／ET 流產(chǎn)（n）移植胚胎D3 D凍融胚胎5異位妊娠（n）2 0 1 0自身對(duì)照組 49 33（86．84） 5（13．16） 95．56±11．73 3（7．89） 3（20．00） 2 1對(duì)照組 80 91（86．67） 14（13．33） 92．93±13．04 14（13．33） 12（29．27）G-CSF組 40 62（75．61） 20（24．39） 93．94±15．55 13（15．85） 10（30．30）

D0（排卵日或黃體酮／HCG注射日）內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、D3／D5胚胎、凍融胚胎復(fù)蘇率、每個(gè)移植周期的胚胎種植率和臨床妊娠率，三組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。與自身對(duì)照組相比，G-CSF組胚胎種植率（15．85%vs．7．89%）和臨床妊娠率（30．30%vs．20．00%）表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，但未達(dá)顯著差異（P＞0．05）（表2）。

由于流產(chǎn)和異位妊娠病例數(shù)非常少，本研究未進(jìn)行組間的比較。在G-CSF組，22個(gè)周期在胚胎移植日測(cè)量子宮內(nèi)膜厚度，在G-CSF宮腔灌注前后內(nèi)膜厚度無(wú)顯著性差異（6．53±0．65mm vs．6．75±1．17mm，P＝0．403）。

討 論

足夠厚度的子宮內(nèi)膜對(duì)于維持正常妊娠的重要性毋庸置疑。雖然內(nèi)膜厚4mm也有成功妊娠的個(gè)案報(bào)告［12］，但大量的臨床實(shí)踐證明內(nèi)膜厚度≤7mm時(shí)，妊娠幾率降低。Dix等［2］報(bào)道內(nèi)膜厚度≤5mm時(shí)新鮮或凍融胚胎移植的臨床妊娠率為8．5%，Singh等［3］報(bào)道內(nèi)膜厚度 ＜6mm 和 6～8mm的妊娠率分別為3．7%和14．8%。

最近，有學(xué)者創(chuàng)新性地將細(xì)胞因子引入薄型子宮內(nèi)膜的治療，受到人們關(guān)注。2011年Gleicher等［9］首次報(bào)道4例子宮內(nèi)膜菲薄的不孕患者應(yīng)用G-CSF治療，均成功獲得妊娠。隨后，他們進(jìn)行了一項(xiàng)隊(duì)列研究，21例平均年齡高達(dá)40．5歲的不孕患者采用G-CSF治療，平均內(nèi)膜厚度從6．4mm增厚至9．3mm，臨床妊娠率為19．1%［10］。這兩項(xiàng)研究都是在卵巢刺激周期應(yīng)用G-CSF，本研究則不同，是在FET周期應(yīng)用G-CSF，藥物劑量（100μg／0．6mL）低于文獻(xiàn)報(bào)道（300μg／mL）。此外，本研究在排卵日或黃體酮／HCG注射日應(yīng)用G-CSF，治療時(shí)機(jī)較為統(tǒng)一，并選擇未應(yīng)用G-CSF的患者作為對(duì)照組，而 Gleicher等［9，10］的研究缺乏對(duì)照組，G-CSF治療時(shí)機(jī)存在差異，在4例個(gè)案報(bào)告中，G-CSF在胚胎移植前2～9d應(yīng)用，而在隊(duì)列研究中，21例患者中有3例（14．3%）接受了第2次G-CSF灌注，其余85．7%的患者只接受單次灌注。

在本組資料中，與自身對(duì)照組或?qū)φ战M相比，G-CSF組誘發(fā)排卵周期比例高，自然周期比例低，而前兩組內(nèi)膜準(zhǔn)備方案無(wú)差異。換而言之，應(yīng)用G-CSF治療的患者內(nèi)膜環(huán)境可能更不理想，以致在FET進(jìn)行內(nèi)膜準(zhǔn)備時(shí)，不得不放棄自然周期而選擇更多的人工方法調(diào)整內(nèi)膜。在相似的內(nèi)膜準(zhǔn)備方案下，自身對(duì)照組周期取消率顯著高于對(duì)照組，也提供了佐證，提示G-CSF治療的患者內(nèi)膜情況較差，正是由于較高的周期取消率，這些患者更傾向于嘗試新方法來(lái)改善內(nèi)膜生長(zhǎng)。

與自身對(duì)照組相比，G-CSF組胚胎種植率由7．89%提高至15．85%，臨床妊娠率由20．00%提高至30．30%，但兩組患者的胚胎種植率和臨床妊娠率并無(wú)顯著差異。原因分析如下：首先，本研究樣本量較小，各組完成的FET周期數(shù)偏少；其次，GCSF治療劑量較小，若采用文獻(xiàn)報(bào)道的藥物劑量，研究結(jié)果可能有所不同；最后，若G-CSF宮腔灌注次數(shù)增多，而不僅僅是在排卵日或黃體酮／HCG注射日單次應(yīng)用，治療效果可能會(huì)出現(xiàn)累積或疊加效應(yīng)。Gleicher等［9，10］報(bào)道 G-CSF灌注后48h內(nèi)內(nèi)膜厚度明顯增厚，而本研究并未觀察到內(nèi)膜厚度的這種明顯變化。在嘗試應(yīng)用G-CSF的初期階段，我們著重關(guān)注G-CSF能否有效地改善薄型子宮內(nèi)膜患者的治療效果和妊娠結(jié)局，所以研究納入的每位患者并沒(méi)有在G-CSF治療后都測(cè)量?jī)?nèi)膜厚度，臨床資料有欠完整，將來(lái)累積病例資料后再行分析比較。

我們知道，G-CSF是功能很強(qiáng)的刺激骨髓造血細(xì)胞增殖分化的細(xì)胞因子，人們較少意識(shí)到，其實(shí)G-CSF還可以作用于人體內(nèi)多種成熟細(xì)胞，促進(jìn)并維持其正常的生理功能。在女性生殖方面，G-CSF被證實(shí)參與卵泡生長(zhǎng)發(fā)育、排卵、卵巢刺激和妊娠等多個(gè)環(huán)節(jié)［13－16］。此外，研究還發(fā)現(xiàn)人子宮內(nèi)膜和母胎界面均有 G-CSF及其受體的表達(dá)［17－19］。在整個(gè)妊娠期間，母體血清G-CSF維持在一個(gè)較高的水平［13］。妊娠早期和足月分娩時(shí)，胎兒絨毛組織和母體蛻膜組織都可以分泌 G-CSF［19］。這些研究為G-CSF的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，然而，外源性宮腔灌注的G-CSF是如何在內(nèi)膜組織發(fā)揮作用以及影響內(nèi)膜容受性和胚胎種植，目前尚無(wú)涉及該方面的機(jī)理研究。我們推測(cè)，外源性G-CSF作為化學(xué)刺激物，宮腔灌注作為機(jī)械刺激，可能激活內(nèi)分泌－旁分泌作用途徑，誘發(fā)內(nèi)源性多種細(xì)胞因子分泌，從而影響內(nèi)膜容受性和胚胎種植。

關(guān)于G-CSF應(yīng)用的安全性，本研究沒(méi)有觀察到任何副反應(yīng)，可能因?yàn)镚-CSF治療是低劑量，并且經(jīng)宮腔灌注局部應(yīng)用。文獻(xiàn)報(bào)道G-CSF主要的不良反應(yīng)是流感樣癥狀，而且非常輕微［20］。慢性中性粒細(xì)胞減少癥患者需要長(zhǎng)期應(yīng)用G-CSF，包括妊娠期間，有研究數(shù)據(jù)表明這些患者的妊娠結(jié)局以及出生子代的生長(zhǎng)發(fā)育未受藥物影響［21］，同樣地，Scarpellini等［22］對(duì)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者應(yīng)用G-CSF治療，也無(wú)不良反應(yīng)報(bào)道。

總而言之，本研究提示G-CSF治療未能顯著改善子宮內(nèi)膜菲薄的不孕患者的胚胎種植率和臨床妊娠率，但不足之處在于這是一項(xiàng)回顧性、非隨機(jī)化、小樣本的臨床資料總結(jié)。鑒于G-CSF是一種探索性的治療方法，仍需要前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究來(lái)驗(yàn)證其療效。今后我們將繼續(xù)在臨床應(yīng)用過(guò)程中不斷摸索不同的治療劑量和治療時(shí)機(jī)，以期尋找GCSF行之有效的治療模式。

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