反復(fù)植入失敗—胚胎因素的重要性

李博，王曉紅

（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，西安 710065）

盡管我們在輔助生殖領(lǐng)域已經(jīng)取得了非常大的成就，但仍然有許多患者承受著反復(fù)種植失敗帶來的巨大的心理壓力和高昂的治療費用。目前，國際上對反復(fù)種植失?。≧ecurrent Implantation Failure，RIF）仍然沒有一個統(tǒng)一的定義，通常將經(jīng)歷2～6次體外受精（IVF）周期或者移植10個高質(zhì)量胚胎仍未獲妊娠，視為RIF［1］。而且在具體的IVF臨床工作中，3次IVF周期未獲妊娠的患者即應(yīng)引起高度重視［2］。

胚胎植入宮腔的過程依賴于很多因素的同步化，如胚胎質(zhì)量、理想的培養(yǎng)條件、子宮內(nèi)膜容受性和母體免疫系統(tǒng)等。植入過程中胚胎與內(nèi)膜的關(guān)系，被很多學(xué)者形象的比喻為“種子”和“土地”之間的關(guān)系。Patrizio等［3］明確提出，RIF的發(fā)生主要由種子（胚胎因素）決定。另外，早在1886年就有宮外孕的報道［4］，而且在1942年英格蘭醫(yī)學(xué)雜志上報道了一篇關(guān)于一位腹腔妊娠后產(chǎn)出活嬰的病例［5］，從而從另一個視角揭示了胚胎在植入過程中的重要作用。

因此，本綜述將從胚胎視角審視其在RIF中扮演的重要角色，并從染色體異常、透明帶硬化、體外培養(yǎng)條件、滋養(yǎng)層細(xì)胞功能以及胚胎早期代謝等方面，進(jìn)行深度的解析和討論。

一、染色體異常

染色體異常主要包括染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常。目前公認(rèn)，在發(fā)生RIF的患者中，高比例的染色體異常是主要原因之一。下面，我們將從父、母雙方染色體和胚胎染色體兩個方面進(jìn)行闡述。

Raziel等［6］以65位重度RIF患者（≥6次IVF周期或者≥15個移植胚胎數(shù)）外周血為材料進(jìn)行核型分析，結(jié)果顯示，染色體結(jié)構(gòu)異常如異位、倒位、微缺失等的比例顯著增高。另有研究也支持此觀點，Stern等［7］觀察到RIF患者中染色體異常的比例為2．5%，且主要表現(xiàn)為異位（相互、羅氏）高發(fā)。因此，他們建議針對這些RIF患者，最好在IVF之前進(jìn)行相應(yīng)的遺傳咨詢。近年來，有學(xué)者專注于精子染色體異常與RIF之間的相關(guān)性研究。Rubio等［8］報道在少弱畸精癥患者夫婦中，植入率和臨床妊娠率均顯著降低，該學(xué)者利用三色熒光原位雜交（FISH）技術(shù)針對13、18、21、X和 Y染色體進(jìn)行了非整倍性和二體性比例的統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，RIF患者進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）治療后，性染色體二體性的比例顯著增高。另有研究證明，精子DNA損傷程度越高，其胚胎植入率和妊娠率越低［9］。而且進(jìn)一步的研究顯示，精子DNA損傷程度的增加與IVF或者ICSI后流產(chǎn)率增加密切相關(guān)［10］。因此，大量證據(jù)表明，不論來自父源或者母源的染色體異常因素，在RIF致病機理中均扮演著重要的角色。

我們知道，染色體非整倍性可以降低胚胎成功植入和妊娠的機率，但遺憾的是，現(xiàn)行的胚胎形態(tài)分級方法無法排除掉非整倍性胚胎，為RIF患者挑選出更具植入潛能的胚胎。有國外學(xué)者對高齡、反復(fù)流產(chǎn)和反復(fù)種植失敗的患者進(jìn)行了胚胎的植入前染色體篩查（Preimplantation Genetic Screening，PGS），數(shù)據(jù)顯示，這些患者在IVF周期內(nèi)獲得的卵母細(xì)胞或者胚胎具有高比例的非整倍性，并分析認(rèn)為，胚胎的非整倍性是植入失敗的主要原因［3］。通過FISH技術(shù)對RIF患者第3天卵裂球的染色體（13、16、18、21、22以及 X和 Y）進(jìn)行檢測，Pehlivan等［11］報道，在發(fā)生3次及3次以上IVF失敗的患者胚胎中，非整倍性比例高達(dá)67%。另有一項研究選擇了20名RIF的患者，仍然是活檢了單個卵裂球，但使用了比較基因組雜交技術(shù)（CGH），結(jié)果顯示，胚胎非整倍性達(dá)到了60%［12］，這與前者的研究相一致。該項研究中檢測的染色體異常，包括一兩條染色體非整倍性和復(fù)雜的染色體異常，因此，研究者認(rèn)為，在人類早期胚胎中，不論是母源細(xì)胞質(zhì)因子還是細(xì)胞周期控制因子突變造成的染色體復(fù)制和分離障礙，均是引起RIF的主要原因。

二、透明帶硬化

哺乳動物的卵子周圍被一層透明帶包被著，透明帶主要由糖蛋白、碳水化合物以及透明帶特異蛋白組成［13］。透明帶在精子結(jié)合、誘導(dǎo)頂體反應(yīng)以及精卵結(jié)合方面發(fā)揮著重要作用［14］。在自然狀況下，精卵結(jié)合后會發(fā)生透明帶硬化，這是一種生理性變化，主要起到阻止多精受精、保護(hù)植入前胚胎完整性和有利于輸卵管運輸?shù)淖饔茫?5］。在早期卵裂時期，透明帶的存在可以維持內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的完整性，但是在囊胚擴(kuò)張時期，必須先發(fā)生孵化，才能完成植入［16］。在生殖領(lǐng)域，出于生殖力保存或者因為某些原因無法進(jìn)行新鮮周期移植的原因，我們通常會通過冷凍技術(shù)，將卵母細(xì)胞和胚胎進(jìn)行冷凍。有學(xué)者認(rèn)為，冷凍后卵母細(xì)胞的皮質(zhì)顆粒會提前釋放，造成透明帶硬化，從而影響精子穿透卵母細(xì)胞的能力［17］。1992年，Wood等［18］研究發(fā)現(xiàn)，冷凍－解凍后透明帶發(fā)生硬化會明顯阻礙受精過程，尤其影響體外受精時精子的穿透。導(dǎo)致受精失敗的機制可能是透明帶硬化會消耗精子的能量，降低精子穿透，并且改變精子頭部的結(jié)合位點。Tian等［19］研究發(fā)現(xiàn)，冷凍劑處理和開放式拉長塑料細(xì)管法冷凍綿羊卵母細(xì)胞，透明帶消化時間明顯比對照組長。冷凍劑毒性試驗組和玻璃化冷凍組單精子入卵率顯著低于對照組。由于冷凍劑毒性試驗組和玻璃化冷凍組透明帶消化時間和單精子入卵率相比差異不顯著，故認(rèn)為，只有將卵母細(xì)胞暴露于冷凍劑中才會引起透明帶硬化和導(dǎo)致精子穿透率降低。囊胚期擴(kuò)張后透明帶的裂解失敗，會造成孵化受損和RIF發(fā)生［15］。有研究顯示，凍融過程會導(dǎo)致透明帶增厚和彈性下降，影響胚胎的孵化，而通過對解凍后胚胎的激光輔助孵化，可以顯著提高植入率和臨床妊娠率［20］。

三、體外培養(yǎng)條件

使用高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)液無疑是IVF成功的基礎(chǔ)。不完善的胚胎培養(yǎng)體系會損害胚胎發(fā)育潛能［21］，進(jìn)而導(dǎo)致RIF發(fā)生。因此，我們需要通過滲透壓檢測、pH測定和精子生化實驗等保證培養(yǎng)系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化。而且，在某些RIF患者中，也許我們有必要采用一些個性化的培養(yǎng)方案來優(yōu)化胚胎發(fā)育。

在IVF臨床，大約有3%的患者會因為胚胎質(zhì)量太差而發(fā)生無可用胚胎移植或者植入失敗。Sermondade等［22］選擇了一些IVF反復(fù)受精失敗的患者，這些患者的獲卵數(shù)和受精率都是正常的，但當(dāng)胚胎發(fā)育到第2天的時候便發(fā)生了高比例（60%）的碎片化（≥40%）。因此，研究者們改變了移植策略，在原核期便進(jìn)行了移植，結(jié)果獲得了單胚6．4%的臨床妊娠率和18．9%的活產(chǎn)率。并且進(jìn)一步得出結(jié)論，不合適的體外培養(yǎng)條件會大大影響本來質(zhì)量就不好的胚胎發(fā)育，從而導(dǎo)致胚胎植入失敗。

四、滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞

在胚胎發(fā)育成桑椹胚后，桑椹胚進(jìn)一步發(fā)育，細(xì)胞開始出現(xiàn)分化。聚集在胚胎的一端，個體較大的細(xì)胞，稱為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM），而沿透明帶內(nèi)壁擴(kuò)展和排列的，個體較小的細(xì)胞，稱為滋養(yǎng)層細(xì)胞（Trophectoderm，TE），它們在胚胎植入過程中發(fā)揮著重要的作用，將來會發(fā)育成胎膜和胎盤。

在植入發(fā)生之前，哺乳動物的胚胎必須脫離透明帶的包被，才能與子宮內(nèi)膜發(fā)生實質(zhì)性的接觸。關(guān)于透明帶裂解的機制目前不是十分清楚。很多的研究都停留在描述性研究的層面，通過體外觀察，描述如下：透明帶的裂解始于囊胚擴(kuò)張，不斷的擴(kuò)張使得透明帶變得越來越薄，直至發(fā)生裂解，使得囊胚從透明帶的包裹中排出，樣子看起來就像一個啞鈴，這個過程稱為孵化。但是這樣的孵化模型受到了越來越多的質(zhì)疑［23］，并且對胚胎發(fā)育潛能的預(yù)測意義不大［24］。TE細(xì)胞質(zhì)突觸在透明帶裂解以及植入中的作用，引起了人們的關(guān)注。關(guān)于TE細(xì)胞質(zhì)突觸的研究不多，最早的要追溯到1883年，Spee等［25］在豚鼠中第一次描述了TE細(xì)胞質(zhì)突觸可以穿透透明帶，多年后Blandau等［26］驗證了他們的研究結(jié)果。1990年，有學(xué)者通過小鼠胚胎TE細(xì)胞質(zhì)突觸的體外觀察，發(fā)現(xiàn)植入前囊胚、植入延遲的囊胚與發(fā)生植入的囊胚相比，TE細(xì)胞質(zhì)突觸的有無和形態(tài)區(qū)別很大，并認(rèn)為其在囊胚植入過程中起著重要的作用［27］。Gonzales等［28］利用先進(jìn)的Time-lapse技術(shù)對馬、牛和人類胚胎進(jìn)行了實時觀察，結(jié)果顯示，在囊胚期，這三類胚胎的TE細(xì)胞確實會長出細(xì)胞質(zhì)突觸，進(jìn)而通過生長和一定角度的運動穿透透明帶（圖1），并且證明隨后發(fā)生的胚胎孵化過程，正是位于這個穿透點［24］（圖2），TE細(xì)胞質(zhì)突觸主要起到穿透和在子宮內(nèi)膜上錨定的作用。2010年Stoikos等［29］研究顯示，高濃度的activin A分子可以抑制TE細(xì)胞中具有粘附能力的分子的表達(dá)，從而導(dǎo)致植入失敗。近年來，許多研究顯示，TE細(xì)胞的質(zhì)量對胚胎植入和活產(chǎn)率有很好的預(yù)測作用。由此可見，TE細(xì)胞確實在胚胎植入過程中發(fā)揮著重要的作用。

圖1 TE細(xì)胞質(zhì)突觸通過一系列角度運動穿透透明帶［24］

圖2 胚胎孵化發(fā)生在TE細(xì)胞質(zhì)突觸穿透點［24］

五、胚胎發(fā)育潛能預(yù)測

從前面的論述中，我們可以看到，現(xiàn)行的胚胎形態(tài)學(xué)評價體系，還不足以精準(zhǔn)地篩選出發(fā)育潛能好的胚胎，那么，除了我們前面提到的PGS和植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）的方法外，還有什么指標(biāo)可以預(yù)測胚胎的發(fā)育和植入潛能呢？

人類白細(xì)胞抗原G（HLA-G）屬非經(jīng)典 HLA－I類抗原，最早在人類胎盤組織中發(fā)現(xiàn)［30］，主要在母胎界面的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞上表達(dá)［27］，是母體對同種半異體抗原的胎兒免疫應(yīng)答中重要的免疫耐受分子。有研究表明，可溶性 HLA-G（sHLA-G）存在于體外培養(yǎng)幾天后的胚胎培養(yǎng)液中，由胚胎分泌，并且與胚胎的植入潛能密切相關(guān)［31］。Yao等［32］研究了HLA-G分子在植入前胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在2細(xì)胞卵裂期開始，便有不同亞型的HLA-G分子開始表達(dá)，當(dāng)胚胎發(fā)育至囊胚期時，HLA-G便開始特異性表達(dá)于滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，開始為植入做準(zhǔn)備。王曉紅等［33］也證明了在卵裂早期便有HLA-G分子的表達(dá)，與上述結(jié)論一致。巨瑛等［34］收集了41名患者的84份胚胎培養(yǎng)液，通過ELISA方法測定了sHLA-G的濃度，sHLA-G陽性率為52%（44／84），陽性培養(yǎng)液中sHLA-G 濃度為3．7～16．6ng／ml。移植至少一個sHLA-G陽性胚胎的妊娠率為69%，移植胚胎全部為sHLA-G陰性者的妊娠率為18%，差異顯著（P＜0．05）。另外，F(xiàn)ishel等［35］通過腹腔鏡手術(shù)獲取卵母細(xì)胞，并進(jìn)行了體外受精和培養(yǎng)，結(jié)果顯示，在胚胎卵裂早期，無法檢測到β-HCG，當(dāng)胚胎發(fā)生致密化時，便可以檢測到β-HCG含量，囊胚時期達(dá)到43U／L，孵化后達(dá)到6，033U／L，差異極顯著（P＜0．01）。大量研究顯示，β-HCG 與胚胎植入密切相關(guān)［36－38］。

胚胎植入失敗還與子宮內(nèi)膜容受性以及胚胎與子宮之間的對話有關(guān)，但正如我們上面的論述一樣，胚胎質(zhì)量在其中起到了非常重要的作用，而且這種重要性甚至遠(yuǎn)超我們的理解和想象。

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