海參多糖對環磷酰胺誘導生殖系統受損小鼠生精功能的影響

高 林，高 華，葛明東

(1青島大學醫學院藥學院，山東青島266021;2高密市人民醫院)

近年來，氧自由基在各種疾病發病機制中的作用倍受重視。精子膜脂質中的多不飽和脂肪酸能與自由基發生脂質過氧化作用，損傷精子膜，使精子活力下降以至喪失［1，2］。環磷酰胺(CP)是一種雙功能細胞毒性烷化劑，對生殖系統，尤其對生精功能有損害。研究證實，自由基損傷機制與CP引起的生精功能障礙關系密切［3，4］。多糖類化合物具有提高免疫力、抗氧化和抑制腫瘤生長的作用［5～7］，但很多研究是針對真菌多糖類和植物多糖類［8，9］，很少對動物多糖進行研究。2012年11月～2013年6月，我們利用從海參中提取的海參多糖(PSC)飼養小鼠，以睪丸的生精作用和抗氧化指標為參數，初步觀察了PSC在CP使用過程中對生殖系統的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明種雄性小鼠40只，鼠齡10～12周，體質量25～35 g，購于山東省魯抗醫藥股份有限公司;室溫下飼養，自由飲水和攝食。質量分數0.95的PSC，青島大學藥學院制備;生理鹽水，辰欣藥業股份有限公司;總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒，南京建成生物工程研究所;注射用CP(0.2 g/瓶)，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。AR5120型電子天平，奧豪斯國際貿易上海有限公司;DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司;生物攝像顯微鏡B1系列，麥克奧迪實業集團有限公司;LD4-2A型低速離心機，北京雷勃爾離心機有限公司;723N型可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備與分組處理 將40只小鼠隨機分成A、B、C、D組各10只，A組腹腔注射生理鹽水，其他各組均腹腔注射CP 28 mg/kg，每天1次，連續5 d;同時，C、D 組分別給予 PSC 300、600 mg/kg灌胃，A、B組給予同體積的蒸餾水灌胃，每天1次，連續4周。

1.2.2 精子采集與指標分析 末次給藥24 h后，脫頸椎處死小鼠;快速剝離附睪并稱重，加入0.5 mL生理鹽水后剪碎;37℃水浴溫育5 min，游離附睪中的精子制成懸液。取25 μL精子懸液滴于血球計數板上，計算精子總數和運動率;另取10 μL精子懸液滴在載玻片上，伊紅染色，顯微鏡觀察，計算精子畸形率。

1.2.3 睪丸組織中蛋白質水平及T-SOD活力測定快速取出一側睪丸，按質量(g)、體積(mL)比1∶9加入生理鹽水;冰水浴條件下勻漿，制備成10%的勻漿液;以2 500～3 000 r/min離心10 min，取上清液。考馬斯亮藍法測定勻漿中的蛋白質，羥胺法測定TSOD活力。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。數據以±s表示，進行單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組生存狀態觀察 A組一般情況良好，運動活潑有力，反應敏捷，食欲健旺;鼠毛柔順濃密有光澤，肌肉發達，體質量維持在一定水平并逐漸增長。而其他各組腹腔注射CP后，進食減少，萎靡少動;并且，毛色干枯發黃無光澤，體質量均出現了一定程度減輕。C、D組體質量均有不同程度增長，其中D組增長較為明顯。

2.2 各組精子指標比較 見表1。

表1 各組小鼠精子密度、運動率及畸形率比較(n=10，±s)

表1 各組小鼠精子密度、運動率及畸形率比較(n=10，±s)

注:與A 組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與B 組比較，○P ＜0.01;與 C 組比較，△P ＜0.05，□P ＜0.01

組別 精子密度(×107/mL)精子運動率(%)精子畸形率(%)A組4.417 ±0.417 47.50 ±4.37 30.33 ±1.63 B 組 2.133 ±0.509# 28.33 ±6.31# 36.67 ±0.82#C 組 4.083 ±0.293○ 40.83 ±2.93＊○ 32.00 ±1.41＊○D 組 4.590 ±0.290○△ 50.67 ±4.55○□ 31.67 ±1.21○

2.5 各組睪丸組織蛋白水平及T-SOD活力比較見表2。

表2 各組睪丸組織蛋白水平及T-SOD活力比較(n=10，±s)

表2 各組睪丸組織蛋白水平及T-SOD活力比較(n=10，±s)

注:與A 組比較，*P ＜0.01;與B 組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01;與 C 組比較，○P ＜0.05

組別 10%蛋白水平(g/L) T-SOD(U/mgprot)A組6.55 ±0.91 46.38 ±6.30 B 組 5.30 ±0.23* 38.59 ±4.73*C 組 6.07 ±0.21# 53.30 ±6.28△D 組 6.77 ±0.59△○ 56.89 ±4.71*

3 討論

隨年齡增加，機體清除自由基的能力降低，打破了氧化—抗氧化系統的平衡，主要表現為氧化作用增強、抗氧化能力減弱;自由基過量后產生過氧化脂肪，從而引起機體損傷［10］。CP作為臨床上常用的抗腫瘤藥物和免疫抑制劑，其致生精功能損害已為眾多基礎及臨床研究所證實［11］。研究報道，CP誘導睪丸生精障礙的機制主要有:①損傷生殖細胞遺傳物質，誘導生精細胞凋亡;②干擾A型精原細胞自我更新增殖和分化功能;③破壞精子發生微環境，包括生精小管細胞層數減少，結構紊亂，Sertoli細胞形態變化，生殖細胞脫落，精子發生障礙;④抑制睪丸3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSD)和17β-HSD的活性，從而降低血清睪酮水平，減少生殖細胞數目［12］。

睪丸是產生精子和分泌睪酮的重要器官，生精小管是產生精子的部位。CP對睪丸氧化性損傷的最直接表現就是破壞睪丸的生精功能。本研究發現，B組小鼠精子數量和運動率降低，并且畸形率增高［13，14］;而PSC能減輕CP的毒性作用，有效提高精子數量，降低畸形率，一定程度保護了小鼠的生殖功能;并且隨劑量的增加，緩解作用有增強的趨勢。另外，B組小鼠睪丸組織T-SOD活性顯著降低，提示CP可導致睪丸組織細胞中氧自由基生成增多，T-SOD被大量消耗，不能使過量生成的自由基得以清除，從而加重了脂質過氧化程度，使氧化—抗氧化系統失衡、生殖細胞損傷及代謝障礙，進而損傷生殖系統。與B組比較，給藥各組小鼠睪丸組織T-SOD活性顯著增高，說明PSC能提高睪丸組織T-SOD活性，提高組織細胞抗氧化和清除自由基的能力，有效抑制CP對小鼠睪丸組織中氧化抗氧化系統的破壞。

綜上所述，PSC可以緩解CP對昆明小鼠的生殖毒性，提高睪丸組織的抗氧化能力，一定程度保護其生殖功能。PSC作為一種天然多糖，值得進一步研究開發利用。

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