低氧對人喉鱗癌Hep－2細胞凋亡的影響及其機制探討

董凱峰，張翠紅，宋冬梅，呂 欣，張繼華，薛海濤，趙玉玲，牛英豪

(1河北醫科大學第一醫院，石家莊050031;2白求恩國際和平醫院)

腫瘤發生、發展過程中，常處于缺血、低氧微環境狀態。研究證實，低氧誘導因子α(HIF-1α)是調控腫瘤細胞適應低氧微環境的核心因子，可誘導多種基因表達，是參與細胞凋亡的重要因子之一［1］。近來研究表明，賴氨酰氧化酶(LOX)在不同腫瘤組織及惡性腫瘤細胞系中的表達既有上調又有下調。結果證實，LOX可能具備雙重功能，即抑制或促進腫瘤轉移［2，3］，目前具體作用機制尚不明確。2013年2～7月，我們觀察了低氧對人喉鱗癌Hep-2細胞凋亡的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Hep-2細胞(河北醫科大學第一醫院耳鼻喉頭頸外科凍存)，RPMI1640培養基(Gibico公司);鼠抗人HIF-1α、LOX抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，RNA提取試劑(Invitrigen公司)，cDNA合成試劑盒及擴增試劑盒(北京Trans gene公司)，上、下游引物合成(北京全式金生物公司)，凝膠成像分析系統(美國UVP公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組與培養 將Hep-2細胞在37℃、5%CO2、20%O2環境中培養12 h，細胞進入對數生長期后隨機分為常氧組及低氧組。低氧培養實驗條件為 2%O2、5%CO2、93%N2、37 ℃，具體實驗裝置制作見參考文獻［2］;常氧組原環境繼續培養。24 h后收集兩組細胞。每組實驗重復5次。

1.2.2 細胞凋亡觀察 采用流式細胞儀(FCM)。檢測時隨機抽取待測標本的一部分細胞，將這部分細胞作為隨機樣本進行分析;首先測出樣本細胞總數，再測得其中凋亡細胞占該樣本細胞總數的百分率，即細胞凋亡率。

1.2.3 HIF-1α、LOX 蛋白檢測 采用 Western blot法。收取核蛋白及總蛋白，常規SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉;一抗4℃過夜，次日二抗孵育顯色。Lab work2.0軟件分析蛋白 IOD值，以 HIF-1α(LOX)與Actin的百分比表示 HIF-1α(LOX)蛋白的相對表達量。

1.2.4 HIF-1α、LOX mRNA 檢測 采用 RT-PCR法。Trizol法提取總 RNA，β-actin作內參，每例樣本重復5次。人HIF-1α、LOX mRNA PCR引物序列及反應條件參照文獻［3］。Lab work2.0軟件分析IOD值，以HIF-1α(LOX)與β-actin的百分比表示HIF-1α(LOX)mRNA的相對表達量。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。數據以±s表示，組間比較用t檢驗;相關關系采用Person相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞凋亡情況比較 常氧組細胞凋亡率為13.86% ±0.12%，低氧組為 5.13% ±0.67%，P＜0.05。

2.2 兩組細胞中HIF-1α、LOX蛋白表達比較 低氧組細胞中HIF-1α、LOX蛋白相對表達量分別為28.34% ±0.86%、48.21% ±2.02%，常氧組分別為16.03% ±1.11%、36.21% ±1.02%，P 均 ＜0.05。見圖1。低氧組細胞中HIF-1α與LOX蛋白表達呈正相關(r=0.862，P ＜0.05)。

圖1 兩組細胞中HIF-1α、LOX蛋白表達

2.3 兩組細胞中HIF-1α、LOX mRNA表達比較低氧組細胞中HIF-1α、LOX mRNA相對表達量分別為29.12% ± 1.24%、37.32% ±0.64%，常氧組分別為21.02% ±0.21%、35.43% ±1.41%，P 均 ＜0.05。見圖2。低氧組細胞中 HIF-1α與LOX mRNA 表達呈正相關(r=0.862，P ＜0.05)。

圖2 兩組細胞中HIF-1α、LOX mRNA表達

3 討論

局部低氧是腫瘤微環境的一個重要特征。業已證實，HIF是調節腫瘤細胞適應低氧的關鍵因子。其主要在低氧條件下激活表達，是調節低氧反應性基因表達的共同通路;其可誘導多種基因表達，與腫瘤發生、發展密切相關，給腫瘤治療帶來巨大困難［4，5］。低氧微環境的腫瘤細胞具有高轉移性及耐藥性，導致轉移性腫瘤難以治愈。HIF可在不同程度的低氧微環境下以不同形式存在，不同實驗(生理或病理)條件或不同細胞中通過不同的機制對細胞發揮促凋亡或抗凋亡的作用［6～8］。本研究結果表明，低氧可以一定程度上抑制Hep-2細胞凋亡(P＜0.05)。

LOX可作用在細胞外基質(ECM)的膠原和彈性纖維并催化系列反應，最終形成膠原及彈性纖維間的共價交聯［9，10］，其產生與活性在維系ECM的發育、成熟及結構完整性方面發揮重要作用［11，12］。有研究顯示，LOX表達可能與人類腫瘤細胞低氧環境有關。進一步研究發現，LOX啟動子為功能性的低氧反應元件，HIF-1通過這個低氧反應元件可在mRNA水平誘導LOX表達上調。一些關于頭頸部腫瘤和乳腺癌患者的臨床研究證實，LOX表達水平與腫瘤低氧有明確的相關性。近期研究指出，LOX由HIF-1調控，同時LOX高表達的腫瘤患者遠處轉移幾率增大，生存率降低。還有研究表明，抑制LOX能降低乳腺癌在小鼠身上的轉移幾率［13～15］。

本研究結果表明，低氧能明顯增加Hep-2細胞HIF-1α蛋白及其mRNA表達，同時LOX蛋白及其mRNA表達相應上調;流式細胞術結果顯示，常氧組與低氧組相比Hep-2細胞凋亡率低。推測腫瘤內的低氧微環境導致HIF-1α蛋白表達上調，進而可能調控LOX蛋白表達;同時推斷HIF-1α 可能通過調節LOX表達促進腫瘤的轉移，在喉癌的發生、發展和浸潤轉移過程中發揮重要作用。提示可將HIF-1α及LOX作為治療喉癌的一個新靶點，通過增加腫瘤的氧供來提高療效。

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