急性腦梗死患者MTHFR基因多態性與血漿同型半胱氨酸水平的關系

蔣 萍，臧大維

(1天津醫科大學，天津300070;2天津市第一中心醫院)

同型半胱氨酸(Hcy)是一種含硫氨基酸，參與 甲基循環，通過蛋氨酸及半胱氨酸脫甲基代謝形成。動脈粥樣硬化(AS)是缺血性腦卒中的重要病理基礎，血漿Hcy水平升高可能是缺血性腦卒中的獨立危險因素，可能作用于AS過程及血栓形成前過程［1］。基因和環境因素(如葉酸、維生素 B12的攝入)都會影響血清Hcy水平。5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是蛋氨酸循環中的一個關鍵酶，MTHFR基因在677位點發生突變會影響血清Hcy水平［2］，有 CC(野生型)、CT(雜合突變型)和 TT(純和突變型)3種類型［3］。腦梗死患者中普遍存在高同型半胱氨酸(HHcy)［4］，不同國家、地區血漿 Hcy基礎水平不同，MTHFR基因多態性亦存在差異。流行病學資料顯示，如果Hcy水平過高，腦中風危險性增大。大多實驗顯示，MTHFR基因C677T突變是HHcy成因之一;也有研究指出，1個基因位點的突變并不一定使血漿Hcy水平產生顯著性改變，所以MTHFR基因多態性與Hcy水平相關性仍無定論。本研究在急性腦梗死(ACI)患者中進行MTHFR基因多態性分析，并同時測定血漿Hcy、葉酸、維生素B12、尿酸(UA)水平，探討ACI患者MTHFR基因多態性對Hcy水平的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標準:①ACI符合《全國第四屆腦血管病學術會議修訂》的標準，并經頭顱CT和(或)MRI證實;②所有入組者為天津地區漢族居民，女性均為絕經后婦女。排除標準:有冠心病、慢性胃腸道疾病、腎功能不全、甲狀腺疾病、惡性貧血、腫瘤病史、慢性房顫、下肢靜脈血栓等病史，以及有甲氨蝶呤、茶堿、磷酸二酯酶抑制劑、B族維生素、葉酸服用史。選擇2012年12月～2013年3月天津市第一中心醫院神經內科住院符合納入排除標準的ACI 48例，男29例、女19例，年齡43～87(65 ±10)歲;高血壓病42例，糖尿病29例，有吸煙史20例，飲酒史9例。

1.2 方法

1.2.1 血漿Hcy測定 入院后第2天取清晨空腹靜脈血2 mL，分離血漿;應用Roche P800全自動生化分析儀以循環酶法測定血漿Hcy，試劑盒購自北京森美希克瑪生物科技有限公司。Hcy參考值0～10 μmol/L，Hcy ＞ 10 μmol/L 即為 HHcy，10 ～ 30 μmol/L輕度增高、31～100 μmol/L中度增高、＞100 μmol/L重度增高。

1.2.2 血清葉酸、維生素B12、UA測定 入院后第2天取清晨空腹靜脈血2 mL，分離血清;用ELECSYC-2010型全自動電化學發光免疫分析儀(德國羅氏公司)以化學發光法檢測葉酸、維生素B12，試劑為裝配套試劑。血清葉酸參考值3.5～13 ng/mL，維生素B12參考值300～800 pg/mL。用日立7080生化儀檢測UA，參考范圍208～428 μmol/L(男)，155 ～357 μmol/L(女)。

1.2.3 MTHFR基因C677T檢測 取受檢者靜脈血2 mL，EDTA抗凝，提取人類白細胞基因組DNA(試劑由深圳奧薩制藥有限公司提供)。應用多聚酶鏈反應2-限制性內切酶片段長度多態性技術(PCR2-RFLP)擴增MTHFR基因目的片段，PCR反應體系為25 μL，常規配制。循環周期依次為94℃30 s、65 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，3 循環周期后72 ℃再延伸7 min。擴增產物由識別多態性位點的特異核酸內切酶在37℃酶切1 h。2%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴增產物，根據電泳條帶區分基因型。C/C為僅有274 bp片段，C/T為酶切后既有274 bp又有228 bp片段，T/T有228 bp片段。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料采用±s表示，多組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析(One Way ANOVA);進一步進行組間兩兩比較，若方差齊采用SNK檢驗，若方差不齊采用Games-Howell檢驗;計數資料采用χ2檢驗。對基因頻率在人群中分布進行H-W平衡吻合度檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTHFR基因頻率及等位基因頻率 48例ACI患者中，C/C 型 17例(35.43%)，C/T型 27例(56.32%)，T/T 型 4 例(8.25%);C 等位基因頻率63.59%，T等位基36.41%。基因分布頻率符合H-W基因分布規律，見圖1。

圖1 MTHFRC677T基因PCR-RFLP檢測結果

2.2 不同MTHFR基因型患者ACI傳統危險因素比較 MTHFR基因C/C型男10例、女7例，年齡(64±7)歲;有高血壓15例、糖尿病17例、吸煙7例、飲酒5 例;纖維蛋白原(FIB)為(3.00 ±0.52)g/L，TC(6.149 ± 1.37)mmol/L，TG(1.55 ± 1.44)mmol/L。C/T型男16例、女11例，年齡(64±11)歲;有高血壓24例、糖尿病11例、吸煙11例、飲酒3例;FIB(2.86 ±0.60)g/L，TC(6.07 ±1.74)mmol/L，TG(1.52 ±0.87)mmol/L。T/T 型男 3 例、女 1例，年齡(67±5)歲;有高血壓3例、糖尿病1例、吸煙2 例、飲酒1 例;FIB(3.27 ±0.35)g/L，TC(5.24±0.59)mmol/L，TG(1.04 ±0.13)mmol/L。3 種基因型患者ACI傳統危險因素比較，P均＞0.05。

2.3 MTHFR基因多態性與血漿Hcy水平的關系MTHFR基因 C/C、C/T、T/T患者血漿Hcy分別為(15.78 ±13.60)、(22.81 ± 15.70)、(72.18 ± 62.54)μmol/L，T/T較C/T、C/C血漿Hcy水平顯著增高(P均 ＜0.05)。

2.4 不同血漿Hcy水平與MTHFR基因型的關系血漿 Hcy正常者中 MTHFR基因 C/C、C/T、T/T分別為5、3、0 例，輕度增高者分別為 11、18、1 例，中度增高者分別為1、6、3例。Hcy輕度增高較正常范圍的MTHFR基因型分布無顯著差異，中度較輕度增高的MTHFR基因型分布有顯著差異(P＜0.05)。

2.5 MTHFR基因多態性與血清葉酸、維生素B12、UA的關系 不同MTHFR基因型ACI患者血清葉酸、維生素 B12、UA 比較，P 均 ＞0.05。見表1。

表1 MTHFR基因多態性與葉酸、維生素B12、UA 水平的關系(±s)

表1 MTHFR基因多態性與葉酸、維生素B12、UA 水平的關系(±s)

基因型 葉酸(ng/mL) 維生素B12(pg/mL)UA(μmol/L)C/C 6.97 ±3.17 392.89 ±182.82 301.51 ±93.14 C/T 5.63 ±3.52 334.86 ±116.40 297.61 ±66.87 T/T 5.38 ±2.51 349.75 ±141.98 261.30 ±70.09

3 討論

目前認為ACI的危險因素包括不可干預因素(高齡、性別)和可干預因素(BMI、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、高脂血癥)［5］，但臨床上許多AS性腦梗死患者并無上述傳統危險因素。自1969年MeCully提出Hcy可能與AS相關以來，國內外學者圍繞該問題開展了大量的研究。越來越多的研究表明，HHcy與腦卒中的發生、發展密切相關，Hcy水平輕至中度增高是腦卒中的獨立危險因素之一［6～8］。

Hcy是蛋氨酸經脫甲基后生成的一種含硫氨基酸，為蛋氨酸和半胱氨酸代謝的中間產物。蛋氨酸在ATP酶作用下轉化為S-腺苷蛋氨酸(SAM)，再經甲基轉移轉化為S-腺苷Hcy，后去腺苷即生成Hcy。正常成人血漿Hcy濃度為5～10 μmol/L。據最新標準，人體血中 Hcy ＞ 10 μmol/L 稱為 HHcy［9］。Hcy在體內的代謝途徑主要有3條，其中再甲基化途徑占50%，其余為轉硫途徑或直接釋放到細胞外液。Hcy再甲基化途徑需要葉酸和維生素B12參與:在蛋氨酸合成酶(MS)作用下，以維生素B12為必需輔助因子，5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)作為甲基供體，再甲基化合成蛋氨酸。甲基供體由MTHFR作用于5，10-亞甲基四氫葉酸(5，10-MTHF)形成。

MTHFR cDNA全長 2.2 kb，定位于染色體1p36.3，包括11個外顯子和10個內含子。MTHFR是一種黃素蛋白，是Hcy代謝途徑中的關鍵酶之一，將5-MTHF還原為甲基四氫葉酸，參與Hcy再甲基化過程。理論上，該酶活性下降可使血漿Hcy升高。Frosst等報道了MTHFR基因一個較為常見的錯義突變C677T，MTHFR基因 C677T突變后產生C/C、C/T、T/T 3 種基因型［10］。后來研究發現，MTHFR基因至少有6個位點易發生C→T堿基突變，分別位于 559、677、692、985、1 015、1 081 處，其中第4外顯子的C677T位點堿基突變最為常見，其純合突變可作為HHcy一個重要的遺傳因素。MTHFR基因C677T在世界范圍內具有相對較高的突變率，且在人群中呈多態性分布。已有的研究表明，MTHFR基因C677T在不同國家、同一國家不同地區、同一地區不同民族或種族中的分布有顯著性差異。據報道，在白種人群T/T可高達8%［11］，在黑人中分布頻率最低(＜2%)［12］。對中國漢族、布依族、苗族的研究發現，該位點突變基因型頻率和基因頻率均具有種族差異［13］。

據最新對漢族人群(15 357名)進行篩查的結果，MTHFR基因的T等位基因出現率及T/T突變率南方(海南)較北方(山東)低，分別是24.0%、6.4%和 63.1%、40.8%，其中天津大港地區數值較高為 54.3%、30.4%［14］。本研究選取天津市區 ACI人群為研究對象，48例患者中MTHFR基因C/C型35.43%、C/T 型 56.32%、T/T 型 8.25%，C 等位基因63.59%、T等位基因36.41%，發現MTHFR基因突變率似乎遠不及上述研究的結果，可能與樣本量小有關。本研究發現，3種基因型間性別、高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒人群構成比無顯著差異。Yang等［14］亦發現，MTHFR基因突變與性別無顯著相關性。C677T堿基突變，可使MTHFR的熱敏感性改變而致酶活性改變。當MTHFR基因發生突變顯著降低酶的活性，影響體內Hcy正常代謝，使之在體內堆積。據研究MTHFR基因C/T型酶活性為C/C型的65%，而T/T型酶活性僅為C/C型的30%，導致C/C型血漿Hcy水平較C/T型及T/T型明顯升高［15］。Casas 等［16］通過薈萃分析證實，Hcy 與MTHFR基因677C/T多態性呈量效關系。Yadav等［3］薈萃分析發現，T/T基因型與HHcy的OR為2.26。我們研究發現，MTHFR基因與Hcy水平顯著相關(P＜0.01)，C/C 突變較 C/T、T/T血漿 Hcy水平顯著增高。此結果與Bharatkumar等［17］研究結果一致。也有少數研究顯示，MTHFR(677C-T)純合突變對Hcy血癥影響不明顯［18］。本研究還發現，輕度HHcy者基因分布與非HHcy者無顯著差異，而輕度與中度HHcy基因分布有明顯差異，即說明HHcy與MTHFR基因多態性相關;Hcy中度增高與基因突變關系更大。已有研究表明，C677T突變與輕中度HHcy有關，T/T型血清Hcy水平較C/C型高平均3.5 μmol/L 或高 40%［19］。而 Yilmaz 等［20］研究認為，HHcy明顯增高與UA關系更大。由于本實驗缺乏重度HHcy組，所以尚未驗證。但是比較三組基因型間UA未發現顯著差異，似乎純合子的UA較突變組偏高，與來自日本［21］及韓國［22］的研究結論相反，原因尚不明確。T/T和C/T型的葉酸、維生素B12水平雖然低于C/C型，但是無統計學差異。有研究表明，葉酸不能減少細胞間Hcy濃度或者其相關物質，而是通過影響MTHFR活性而干擾SAM抑制酶發揮調節細胞間甲基代謝的作用［23］。所以，葉酸、維生素B12與MTHFR基因突變是否相關尚需進一步研究。

總之，本研究發現ACI患者MTHFR基因多態性與Hcy顯著相關，Hcy中度增高與該基因突變關系更大。雖然3種基因型葉酸及維生素B12無顯著差異，但有研究證實MTHFR基因C/T、T/T型Hcy在葉酸強化前后都高于C/C型［24］。因此，可根據MTHFR基因型等因素補充不同劑量的葉酸，為我國H型高血壓(伴有HHcy的原發性高血壓［25］)乃至腦血管疾病的預防和治療提供客觀依據。MTHFR基因與UA的關系尚需進一步探討。本研究存在持續時間短、樣本小、代表性不足等局限性，需擴大樣本進一步研究。

［1］Karolczak K，Olas B.Mechanism of action of homocysteine and its thiolactone in hemostasis system［J］.Physiol Res，2009，58(5):623-633.

［2］Ford AH，Flicker L，Alfonso H，et al.Plasma homocysteine and MTHFRC677T polymorphism as risk factors for incident dementia［J］.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2012，83(1):70-75.

［3］Yadav S，Hasan N，Marjot T，et al.Detailed analysis of gene polymorphisms associated with ischemic stroke in South Asians［J］.PLoS One，2013，8(3):e57305.

［4］Herrmann W，Obeid R.Homocysteine:a biomarker in neurodegenerative diseases［J］.Clin Chem Lab Med，2011，49(3):435-441.

［5］Mierzecki A，Bukowska H，Kloda K，et al.Homocysteine and metabolic risk factors in individuals with family history of premature ischemic stroke［J］.Pol Arch Med Wewn，2013，123(6):282-288.

［6］Aronow WS，Ahn C，Gut stein H.Increased plasma homocysteine is an independent predict or of new atherothrombotic brain in farction in older persons［J］.Am J Cardiol，2000(86):585-586.

［7］柴文，吳曉牧，曹文鋒.血漿同型半胱氨酸與腦梗死的相關性［J］.中華腦血管病雜志，2011，5(5):362-366.

［8］Fekih-Mrissa N，Mrad M，Klai S，et al.Methylenetetrahydrofolate reductase(C677T and A1298C)polymorphisms，hyperhomocysteinemia，and ischemic stroke in Tunisian patients［J］.J Stroke Cerebrovasc Dis，2013，22(4):465-469.

［9］Jiang S，Chen Q，Venners SA ，et al.Effect of simvastatin on plasma homocysteine levels and its modification by mthfr c677t polymorphism in chinese patients with primary hyperlipidemia［J］.Cardiovasc Ther，2013，31(4):e27-33.

［10］Yoo JH，Choi GD.Pathogenicity of thermolabile methylenetetrahydrofolate reductase for vascular dementia［J］.Arteriosder Thmmb Vasc，2000，20(8):1921-1925.

［11］Vander Put NM，Eskes TK，Blom HJ.Is the common 677C ＞T mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene a risk factor for neuraltube defects［J］.QJM，1997，90(2):111-115.

［12］Hira B，Pegoraro RJ，Rom L，et al.Polymorphisms in various coagulation genes in black South African women with placental abruption［J］.BJOG，2002，109(5):574-575.

［13］肖雁，單可人，李毅，等.貴州各民族亞甲基四氫葉酸還原酶基因的遺傳多態性［J］.中華醫學遺傳學雜志，2005，22(2):219-221.

［14］Yang B，Liu Y，Li Y，et al.Geographical distribution of MTHFR C677T，A1298C and MTRR A66G gene polymorphisms in China:findings from 15357 adults of Han nationality［J］.PLoS One，2013，8(3):e57917.

［15］Frosst P，Biomh HG，Milosr R，et al.A candidate genetic risk factor for vascular disease:a common mutation in methylaetetrahydrofolate reductase［J］.Nat Genet，1995，10(1):111-113.

［16］Casas JP，Bautista LE，Smeeth L，et al.Homocysteine and stroke:evidence on a causal link from mendelian randomisation［J］.Lancet，2005，365(9455):224-232.

［17］Bharatkumar VP，Nagaraja D，Christopher R.Hyperhomocysteinemia and methylenetetrahy drofolate reductase C677T polymorphism in cerebral venosinus thrombosis［J］.Clin Appl Thromb Hemost，2014，20(1):78-83.

［18］邵燕，章成國，胡學強.血漿同型半胱氨酸及其酶基因多態性與老年腦梗死的關系［J］.臨床神經病學雜志，2006，19(1):22-24.

［19］Gudnason V，Stansbie D，Scott J，et al.C677T(thermolabile alanine/valine)polymorphism in methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR):its frequency and impact on plasma homocysteine concentration in different European populations［J］.Atherosclerosis，1998，136(2):347-354.

［20］Yilmaz MI，Stenvinkel P，Sonmez A，et al.Vascular health，systemic inflammation and progressive reduction in kidney function;clinical determinants and impact on cardiovascular outcomes［J］.Nephrol Dial Transplant，2011，26(11):3537-3543.

［21］Zuo M，Nishio H，Lee MJ，et al.The C677T mutation in the methylenetetrahydrofo1ate reductasegene increases serum uric acid in elderly men［J］.J Hum Genet，2000，45(4):257-262.

［22］Young SH，Myeong JL，Kyeong HK，et al.The C677 mutation in methylenetetrahydrofo1ate reductase gene:correlation with uric acid and cardiovascular risk factors in elderly korean men［J］.J Korean Med Sci，2004，19(2):209-213.

［23］Smith DE，Hornstra JM，Kok RM.Folic acid supplementation does not reduce intracellular homocysteine，and may disturb intracellular one-carbon metabolism［J］.Clin Chem Lab Med，2013，51(8):1643-1650.

［24］Tsai MY，Loria CM，Cao J，et al.Clinical utility of genotyping the 677c＞t variant of methylenetetrahydrofolate reductase in humans is decreased in the post-folic acid fortification era［J］.J Nutr，2009，139(1):33-37.

［25］胡大一，徐希平.有效控制“H型”高血壓—預防卒中的新思路［J］.中華內科雜志，2008，47(12):976-977.