異基因人骨髓間充質干細胞與外周血單個核細胞體外共培養的相互影響

魏開鵬，潘興南，魏梅娟，張小曼，許正鋸

（中國人民解放軍第180醫院肝病中心，福建 泉州 362000）

異基因人骨髓間充質干細胞與外周血單個核細胞體外共培養的相互影響

魏開鵬，潘興南，魏梅娟，張小曼，許正鋸

（中國人民解放軍第180醫院肝病中心，福建 泉州 362000）

目的探討異基因骨髓間充質干細胞(BMSC)與外周血單個核細胞（PBMC）在體外共培養的相互影響。方法將異基因成人來源的BMSC與PBMC在體外分別按1：10混合共培養，采用氚胸腺嘧啶核甙摻入方法檢測PHA刺激PBMC增殖的活性，采用ELISA方法檢測培養液中分泌的IL-6、IL-8和PGE2水平。結果BMSC與PBMC共培養組的PBMC增殖率明顯減少(P＜0.01)，抑制率均超過50%。加入PBMC共培養后，BMSC分泌IL-6、IL-8和PGE2顯著增加(P＜0.01)。結論BMSC可以抑制PHA刺激引起的PBMC增殖，PBMC可以促進BMSC分泌免疫活性因子，BMSC可能具有雙向的免疫調控作用。

骨髓間充質干細胞；外周血單個核細胞；共培養

骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)是一群骨髓來源的具有自我更新和多向分化潛能的間充質干細胞[1]。BMSC由于獲取方便、容易擴增以及良好的倫理適應性而在細胞移植治療方面備受關注[2]。后來發現除了具備干細胞的基本屬性，BMSC還具有獨特的免疫調節作用[3]。動物研究和臨床試驗顯示，BMSC輸注可以延長異基因移植物的存活時間，移植物抗宿主病(GVHD)的發生率顯著降低[4]。本研究通過探討BMSC與外周血單個核細胞(mononuclear cell，PBMC)在體外共培養的相互影響，為認知BMSC的免疫學作用提供體外實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料BMSC來源于3個健康成人志愿者的骨髓，PBMC來源于另外1個健康成人的外周靜脈血，這些供者之間沒有同源關系，與供者均簽署《知情同意書》。LG-DMEM培養液、胎牛血清、成骨細胞誘導試劑盒、軟骨細胞誘導試劑盒和脂肪細胞誘導試劑盒均購自美國Life公司。Ficoll分離液購自美國GE公司。FITC標記的抗人CD14、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105及抗鼠IgG1-κ單抗均購自美國Biolegend公司。檢測IL-6、IL-8和PGE2的ELISA試劑盒購自美國R&D System公司。

1.2 BMSC的分離和鑒定按照本課題組之前所報道的方法[5]，從成人骨髓分離BMSC，并從形態、表型和誘導分化三個方面進行綜合鑒定。將收獲的第3代BMSC分裝凍存到液氮備用。

1.3 PBMC的分離采集人外周靜脈血等量稀釋后沿離心管壁緩慢加到Ficoll分離液上面，注意不要破壞界面，250 g離心30 min后吸棄上層液體，收獲白膜狀的細胞層即PBMC。將PBMC分裝凍存到液氮備用。

1.4 PHA刺激PBMC增殖試驗BMSC按2× 104個/ml密度接種入96孔板，每孔100μl設3個復孔。培養2 h貼壁后加入異基因的PBMC(2×105個/ml，100μl)，并添加PHA(2.5μg/ml)。BMSC與PBMC按1:10混合進行共培養，設置未添加PHA的孔作為對照。在孵箱中持續培養72 h，結束前4 h添加氚胸腺嘧啶核甙(3H-TdR)。培養結束收獲細胞用液閃計數器計數，以每分鐘液閃計數(CPM)表示增殖活性。

1.5 ELISA檢測分泌細胞因子將異基因的BMSC和PBMC按1:10混合共培養24 h(如上所述)，收集細胞培養上清液，采用ELISA方法檢測IL-6、IL-8和PGE2的水平。操作按試劑盒說明書進行，分別檢測單獨培養的BMSC、PBMC作為對照。

1.6 統計學方法應用SPSS16.0軟件進行統計學分析。定量數據以均數±標準差±s)表示，兩組數據間的比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSC的鑒定我們分離到的BMSC具有以下幾個特征：(1)黏附塑料培養瓶底面生長，呈長梭狀的成纖維細胞樣形態并行排列(圖1A-a，b，c)；(2)高表達CD73、CD90和CD105，低表達或不表達CD14、CD34和CD45等表面分子(圖1B)；(3)在特定條件下培養21 d后，它們可被誘導分化成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞(圖1A-d，e，f)。以上特征符合國際干細胞治療協會(ISCT)提出的鑒定標準[6]。

圖1 BMSC的鑒定

2.2 BMSC對PHA刺激PBMC增殖的影響我們將異基因的3個成人的BMSC和另外1個成人的PBMC在體外分別進行共培養，并添加PHA進行刺激。我們發現BMSC與PBMC共培養的組中，PHA刺激引起的PBMC增殖明顯減少(P＜0.01)，各組加入BMSC共培養后的增殖抑制率均超過50%(表1)。以上說明，BMSC對PHA刺激引起的PBMC增殖具有明顯抑制作用。

表1 各組PHA刺激PBMC增殖活性的比較(±s)

表1 各組PHA刺激PBMC增殖活性的比較(±s)

注：3個組的BMSC分別來自3個異基因供者，PBMC來自另外1個異基因供者；用每分鐘液閃計數(CPM)表示增殖活性，實驗重復3次；單獨PBMC或BMSC培養組的CPM均小于1 000。

組別1 2 3 PBMC+PHA 28057±2903 28057±2903 28057±2903 PBMC+PHA+BMSC 11263±2205 13725±2737 10924±2066抑制率(%) 59.86 51.08 61.06 t值7.98 6.22 8.33 P值＜0.01＜0.01＜0.01

2.3 PBMC對BMSC分泌細胞因子的影響我們在體外培養過程中檢測可溶性細胞因子的分泌量，BMSC單獨培養可以分泌IL-6、IL-8和PGE2等免疫活性細胞因子，PBMC單獨培養可以檢測到少量IL-6和IL-8。當我們將異基因的BMSC與PBMC按1：10比例進行共培養后，IL-6、IL-8和PGE2的分泌量均顯著增加(P＜0.01)，其中PGE2的分泌量增加幅度最大(圖2)。

圖2 PBMC對BMSC分泌細胞因子的影響

3 討論

BMSC作為比較原始的基質細胞與基質細胞和內皮細胞等參與構成造血微環境，其表型和功能與胸腺基質細胞相似提示BMSC可能在免疫調節方面有一定的作用[7]。BMSC不表達MHC-Ⅱ類分子和FasL，也不表達CD80、CD86和CD40等共刺激分子[8]。體外實驗證實，將BMSC與異基因外周血PBMC或同種異體T細胞共培養并不引起T細胞的活化增殖[9]。PHA作為一種有絲分裂原可以強烈刺激T細胞活化增殖，但本研究發現添加BMSC共培養后PHA刺激引起的PBMC增殖受到明顯的抑制，說明BMSC除了具有較低的免疫原性和抗原提呈能力，還可以發揮免疫抑制作用。

BMSC具有基質細胞的特性，能夠分泌多種可溶性細胞因子[10]。PGE2不僅可以抑制B細胞介導的體液免疫，也可以抑制T細胞介導的細胞免疫，在體內作為一種重要的負向調節因子維持免疫平衡[11]。我們發現，BMSC體外培養時自身可以分泌少量的PGE2。當與異基因的PBMC混合培養時，BMSC分泌的PGE2急劇增加，這提示PGE2作為一種免疫抑制因子可能在之前觀察到的免疫抑制現象的機制中扮演重要角色。

IL-6促進B細胞和T細胞活化參與炎癥反應，IL-8作為一種趨化因子對炎癥效應細胞具有強烈的趨化作用[12]。我們發現BMSC體外培養時自身也可以分泌少量的IL-6和IL-8。當與同種異體的PBMC混合培養時，這兩種免疫促進因子也明顯升高，這提示BMSC不僅可以分泌細胞因子介導免疫抑制作用，也可以分泌細胞因子促進免疫應答。因此，BMSC在不同的微環境調控下可能具有雙向的免疫調節作用。

綜上所述，BMSC在體外可以抑制PHA刺激引起的PBMC增殖，PBMC可以促進BMSC上調PGE2等免疫抑制因子的分泌，也可以促進BMSC上調IL-6和IL-8等促炎因子的分泌。目前對BMSC與免疫系統的關系并不十分清楚，BMSC可能通過多種途徑與免疫細胞互動發揮雙向免疫調控作用，其具體細節和機制有待進一步的研究。

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Interactions of allogeneic human bone marrow mesenchymal stem cell and peripheral blood mononuclear cell cocultured in vitro.

WEI Kai-peng,PAN Xing-nan,WEI Mei-juan,ZHANG Xiao-man,XU Zheng-ju.
Center of Liver

Disease,the 180thHospital of PLA,Quanzhou 362000,Fujian,CHINA

ObjectiveTo explore the interaction of allogeneic human bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC)and peripheral blood mononuclear cell(PBMC)cocultured in vitro.MethodsHuman BMSC and PBMC isolated from unrelated donors were cocultured(BMSC to PBMC ratio,1:10).3H-TdR incorporation test were used to evaluate PHA-induced proliferation.ELISA test was used to determine the levels of IL-6,IL-8 and PGE2 in cell culture supernatant.ResultsThe presence of BMSC resulted in a statistically significant(P＜0.01)decrease in PHA-induced proliferation in PBMC and the inhibition rate was more than 50%.The levels of IL-6,IL-8 and PGE2 significantly(P＜0.01)increased when PBMC were added to BMSC.ConclusionBMSC can mediate suppression of PHA-induced PBMC proliferation.PBMC can promote BMSC to secrete positive and negative immune factors.BMSC may have dual effects on immune reactions.

Bone marrow mesenchymal stem cell(BMSC);Peripheral blood mononuclear cell(PBMC);Coculture

R329.2+8

A

1003—6350（2014）17—2507—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.17.0982

2014-03-25)

泉州市社會發展計劃重點項目（編號：2012Z60）

魏開鵬。E-mail：kpweicn@163.com