LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅲ)

陳峰，李海龍，譚銀豐，賴偉勇

(1.海南省藥用植物研究與開發重點實驗室，海南 海口 571101；2.海南醫學院藥學院，海南 海口 571101)

LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅲ)

陳峰1,2，李海龍1,2，譚銀豐1,2，賴偉勇1,2

(1.海南省藥用植物研究與開發重點實驗室，海南 海口 571101；2.海南醫學院藥學院，海南 海口 571101)

目的研究大鼠灌胃縮泉膠囊后益智中二芳基庚烷類成分(益智酮甲、益智酮乙、益智醇)在大鼠膽汁中的物質形式。方法雄性Sprague Dawley大鼠膽管插管手術完畢經灌胃給予縮泉膠囊(1.64 g/kg)后收集0～4 h膽汁。同體積(100 μl)的兩份膽汁樣品分別經蛋白沉淀和β-葡萄糖醛酸水解酶(1 000 U/ml，pH為5的乙酸鈉緩沖液)處理后，所得樣品利用液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS/MS)進行分析。結果在大鼠膽汁中幾乎檢測不到益智二芳基庚烷類成分的原形物質形式，而是以葡萄糖醛酸結合物的形式存在。這些二相代謝物經酶水解處理后代謝物的色譜峰消失，釋放出二芳基庚烷類成分的原形物質。結論大鼠灌胃給藥后經腸道吸收的二芳基庚烷類成分在膽汁中形成葡萄糖醛酸結合產物，酶水解可以釋放出原形物質形式。本研究可以幫助我們理解這類物質的體內轉運過程，也為后期的定量分析工作奠定基礎。

縮泉膠囊；益智；二芳基庚烷類；液相色譜-質譜聯用儀

縮泉丸源于宋代《魏氏家藏方》[1]，由益智仁、烏藥和山藥組成，用于治療多尿、尿頻、遺尿，被2010版《中國藥典》一部收載[2]，是治療尿失禁的為數不多的中藥之一。方中以益智仁溫補腎之陽，固氣澀精為君藥。縮泉丸在國內9家企業生產(其中8個為水丸，1個為膠囊)，其中縮泉膠囊在2012年的銷售額達到5 000萬元。縮泉丸多成分體內過程研究較為薄弱，機體如何處置縮泉丸中的化學物質尚待闡明。本課題組前期分析了縮泉丸中主要成分的含量[3]，并對大鼠灌胃縮泉丸后主要成分益智酮甲在大鼠系統中的暴露進行了初步研究[4]。針對君藥中黃酮類物質的膽汁排泄已經進行了研究(另文發表)，本文主要探討二芳基庚烷類成分在大鼠膽汁中的物質形式，以了解這類物質的體內轉運過程。

1 材料與方法

1.1 試藥益智酮甲、益智酮乙和益智醇購自凱方醫藥科技(上海)有限公司，以上化合物的純度均在98%以上，結構、分子式和分子量見圖1。β-葡萄糖醛酸水解酶(HP-2型，來自海曼蝸牛，每毫升含有100 000 U的β-葡萄糖醛酸水解酶和7 500 U的硫酸酯酶水解酶)購自Sigma公司。縮泉膠囊購自湖南漢森藥業有限公司(批號110602)。

圖1 益智酮甲、益智酮乙和益智醇的結構式

1.2 實驗動物、給藥和樣品采集同“LC-MS/ MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)”。

1.3 膽汁樣品的處理甲醇沉淀：同“LC-MS/ MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)”。酶水解：同“LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅱ)”。

1.4 LC-MS/MS分析方法

1.4.1 色譜條件同“LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)”。

1.4.2 質譜條件質譜條件同“LC-MS/MS法測定大鼠口服縮泉膠囊后膽汁中的代謝物(Ⅰ)”。益智酮甲、益智酮乙和益智醇檢測離子對分別為313.2→136.9，311.2→117.0和315.3→137.0。上述3個二芳基庚烷類成分的二相代謝產物的檢測離子對分別為益智酮甲葡萄醛酸化代謝物489.2→313.2，益智酮甲硫酸酯結合物393.2→313.2，益智酮乙葡萄醛酸化代謝物487.2→311.2，益智酮乙硫酸酯結合物391.2→311.2，益智醇葡萄醛酸化代謝物491.3→315.3和益智醇硫酸酯代謝物395.3→315.3。

2 結果

2.1 膽汁中益智酮甲的測定大鼠灌胃縮泉膠囊后，膽汁樣品經甲醇沉淀后，檢測不到益智酮甲的原形物質(保留時間為6.90 min)，主要是益智酮甲的葡萄糖醛酸結合物(保留時間為5.72 min)，見圖2。相同來源的膽汁樣品經β-葡萄醛酸水解酶水解后葡萄糖醛酸結合物被水解，釋放出益智酮甲的原形物質，見圖3。

2.2 膽汁中益智酮乙的測定大鼠灌胃縮泉膠囊，膽汁樣品經甲醇沉淀后益智酮乙的原形物質(保留時間為7.14 min)幾乎檢測不到，可以檢測到益智酮乙的葡萄糖醛酸結合物(保留時間為5.57 min)，見圖4。大鼠膽汁樣品經β-葡萄醛酸水解酶水解后葡萄糖醛酸結合物被水解，釋放出益智酮乙的原形物質(保留時間7.11 min)，但響應比較低，見圖5。

圖2 甲醇沉淀處理后益智酮甲及二相代謝產物的測定

圖3 酶水解處理后益智酮甲及二相代謝產物的測定

圖4 甲醇沉淀處理后益智酮乙及二相代謝產物的測定

圖5 酶水解處理后益智酮乙及二相代謝產物的測定

2.3 膽汁中益智醇的測定大鼠灌胃縮泉膠囊，膽汁樣品經甲醇沉淀后檢測不到益智醇的原形物質(保留時間為6.88 min)，主要是益智醇的葡萄糖醛酸結合物(保留時間為5.71 min)，結果見圖6。膽汁樣品經β-葡萄醛酸水解酶水解后葡萄糖醛酸結合物被水解，釋放出益智醇的原形物質，見圖7。

圖6 甲醇沉淀處理后益智醇及二相代謝產物的測定

圖7 酶水解處理后益智醇及二相代謝產物的測定

3 討論

二芳基庚烷類成分(益智酮甲、益智酮乙和益智醇)是益智的代表性化學成分，也是縮泉膠囊中一類主要活性物質。益智酮甲和益智酮乙具有抗炎、抗腫瘤、抗菌和胃保護作用[5-9]。在縮泉膠囊中益智酮甲是益智酮乙含量的20倍以上，而益智酮乙和益智醇含量相當[3]。大鼠灌胃給予縮泉膠囊后，血漿中檢測到微量的游離型益智酮甲，未檢測到益智酮乙[4]。這些成分有可能存在明顯的首過消除。

通過本文的研究，我們發現在大鼠膽汁樣品中幾乎檢測不到游離型的益智酮甲、益智酮乙和益智醇，這些物質多轉化為葡萄糖醛酸結合物。經β-葡萄糖醛酸水解酶孵化處理，釋放出原形物質形式。盡管如此，益智酮乙的響應也是很低的，一方面是因為制劑中的含量較低。另一方面，在大鼠體內，這些二芳基庚烷類成分存在代謝轉化，益智酮乙還原為益智酮甲，再還原為益智醇(另文發表)。

因此，益智二芳基庚烷類成分在大鼠體內存在明顯的膽汁消除。本文的研究可以幫助我們理解這類物質的體內轉運過程，也為定量分析工作奠定基礎。

[1]孫世發.縮泉丸方來源淺析[J].中醫雜志,1994,35(7):439.

[2]國家藥典委員會.《中國藥典》2010版.北京:中國醫藥科技出版社.2010:1218.

[3]Chen F,Li HL,Li YH,et al.Quantitative analysis of the major constituents in Chinese medicinal preparation SuoQuan formulae by ultra fast high performance liquid chromatography/quadrupole tandem mass spectrometry[J].Chem Cent J,2013,7(1):131.

[4]Chen F,Li HL,Tan YF,et al.Validated method to measure yakuchinone A in plasma by LC-MS/MS and its application to a pharmacokinetic study in rats[J].Chem Cent J,2014,8(1):2.

[5]Lin RJ,Yen CM,Chou TH,et al.Antioxidant,anti-adipocyte differentiation,antitumor activity and anthelmintic activities against Anisakis simplex and Hymenolepis nana of yakuchinone A from Alpinia oxyphylla[J].BMC ComplementAltern Med,2013,13:237.

[6]Yamazaki R,Hatano H,Aiyama R,et al.Diarylheptanoids suppress expression of leukocyte adhesion molecules on human vascular endothelial cells[J].Eur J Pharmacol,2000,404(3):375-385.

[7]Chun KS,Park KK,Lee J,et al.Inhibition of mouse skin tumor promotion by anti-inflammatory diarylheptanoids derived from Alpinia oxyphylla Miquel(Zingiberaceae)[J].Oncol Res,2002,13(1):37-45.

[8]Chun KS,Kang JY,Kim OH,et al.Effects of yakuchinone A and yakuchinone B on the phorbol ester-induced expression of COX-2 and iNOS and activation of NF-kappaB in mouse skin[J].J Environ Pathol Toxicol Oncol,2002,21(2):131-139.

[9]Chun KS,Sohn Y,Kim HS,et al.Anti-tumor promoting potential of naturally occurring diarylheptanoids structurally related to curcumin[J].Mutat Res,1999,428(1-2):49-57.

Identification of metabolites in bile of rat with Suoquan Capsules using LC-MS/MS(Ⅲ).

CHEN Feng1,2,LI

Hai-long1,2,TAN Yin-feng1,2,LAI Wei-yong1,2.
1.Hainan Provincial Key Laboratory of R&D of Tropical Herbs,Haikou 571101,Hainan,CHINA;2.School of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo identify the diarylheptanoids(yakuchinone A,yakuchinone B and oxyphyllacinol) and their metabolites in rat bile after oral administration of Suoquan capsules.MethodsCannulas were surgically inserted into the bile duct of male Sprague-Dawley rats(n=3)under anesthesia(pentobarbital,50 mg/kg,i.p.)and bile was collected for 4 h after oral administration of Suoquan capsules(1.64 g/kg,suspended in 0.5%w/v sodium carboxymethycellulose).After methanol precipitation or β-glucuronidase(1 000 units/ml in pH 5 acetate buffer)treatment, these chemicals and their phaseⅡmetabolites in rat bile samples were analyzed via liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)with selected reaction monitoring mode.ResultsThe parent compounds could not be measured in rat bile sample treated by methanol precipitation.On the contrast,glucuronidated metabolites were recovered in rat bile.After enzymatic hydrolysis treatment via β-glucuronidase,the corresponding parent chemicals were librated from their conjugated forms.ConclusionAfter oral administration,the absorbed diarylheptanoids were partly biotransformed to glucuronide conjugates and excreted into rat bile.This study is helpful for better understanding of these diarylheptanoids’fates in rat and quantitative analysis of these compounds in rat bile samples in the future.

Suoquan Capsules;Alpinia oxyphylla(Yizhi);Diarylheptanoids;LC-MS/MS

R-332

A

1003—6350（2014）17—2503—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.17.0981

2014-03-04)

2011年海南省自然科學基金項目(編號：812189，813188，813196)，海南醫學院青年培育基金項目(編號：HY2012-013)

賴偉勇。E-mail：13807660389@163.com