肺炎克雷伯菌介導致碳青霉烯類耐藥的基因檢測研究

于親德，徐平，于勇文，王曙光，馮桂梅

(1.長沙市航天醫院藥劑科，湖南 長沙 410205；2.中南大學湘雅醫院(附一醫院)藥劑科，湖南 長沙 410008)

肺炎克雷伯菌介導致碳青霉烯類耐藥的基因檢測研究

于親德1，徐平2，于勇文1，王曙光1，馮桂梅1

(1.長沙市航天醫院藥劑科，湖南 長沙 410205；2.中南大學湘雅醫院(附一醫院)藥劑科，湖南 長沙 410008)

目的分析碳青霉烯類耐藥型肺炎克雷伯菌的耐藥性及耐藥基因型。方法分離碳青霉烯類耐藥型肺炎克雷伯菌14株，分別采用E-test實驗、改良的Hodge試驗、脈沖場瓊脂糖凝膠電泳分型及多位點序列分型測定其耐藥性、耐藥基因型及主要流行序列型。結果14株碳青霉烯類耐藥型肺炎克雷伯菌對常用碳青霉烯類抗生素亞胺培南和美羅培南呈中高度耐藥，最低抑菌濃度(MIC)分別為8～64 mg/L、16～128 mg/L；對常見頭孢類抗生素頭孢哌酮、頭孢西丁、頭孢他啶和頭孢吡肟均呈高度耐藥，MIC 32～256 mg/L；對喹諾酮類藥物環丙沙星呈中度耐藥，MIC 3～32 mg/L；對氨基糖苷類抗生素阿米卡星不穩定，MIC＜0.12～256 mg/L。本組碳青霉烯類耐藥型肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶表型檢測均為陽性，基因型屬KPC-2；脈沖電泳分型顯示A克隆2株、B克隆9株、C克隆3株，多位點序列分型顯示ST11 9株、ST15 4株、ST439 1株，分型結果基本一致。結論碳青霉烯類耐藥型肺炎克雷伯菌對部分其他種類的抗生素亦有較強耐藥性，KPC-2型碳青霉烯酶是本院肺炎克雷伯菌產生青霉烯類耐藥性的主要原因，主要流行克隆型和序列型分別為B型、ST11型。

肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；抗生素；耐藥；基因檢測

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KNP)與大腸埃希菌、陰溝腸桿菌并稱為臨床三大腸桿菌。事實上，除消化系統和呼吸系統外，KNP在泌尿系統及血液系統疾病中亦有較高的感染率，已成為臨床分離及醫院感染的重要致病菌之一[1]。碳青霉烯類抗生素是臨床治療腸桿菌科細菌重癥感染的首選藥物，籍其抗菌譜廣、抗菌活性強、耐受β-內酰胺酶水解及低毒等優勢得以迅速普及和應用。然而近年報道顯示，隨著其臨床使用頻率的增加，碳青霉烯類抗生素的耐藥性日漸凸顯，成為制約其臨床療效的重要原因之一，以KNP最為突出。研究表明[2-3]，KNP產生碳青霉烯耐受的機制主要是產生碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemases，KPC)。國外研究對該酶進行了DNA條帶圖譜和基因序列分型，對其分型的掌握有助于明確其流行病學特征和耐藥機制。本研究對院內重癥監護病房分離的14株碳青霉烯類抗生素耐受型KNP做了耐藥性和基因型檢測，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要菌株本院重癥監護病房2012年9月至2013年9月分離的14株KNP。分離來源：痰液3株，膿性分泌物7株，腹水2株，血液2株。入選標準：所有細菌采用細菌全自動鑒定儀鑒定為肺炎克雷伯菌，并對亞胺培南和亞胺培南耐藥。

1.1.2 主要儀器細菌全自動鑒定儀(Vitek 2，BioMerieux)；脈沖場凝膠電泳儀(CHEF Mapper XA System，Bio-Rad)；電熱恒溫培養箱(DNP-9162，上海精宏實驗設備有限公司)；核酸電泳儀(QSEP100，BiOptic Inc)；紫外線凝膠成像儀(FR-980，上海復日)；PCR擴增儀(5334，Eppendorf)；激光掃描儀(TYPOON9200，Pharmacia Biotech)；紫外交聯儀(DTK3-DTY-2010，北京中西遠大生物技術有限公司)等。

1.1.3 主要試劑大腸埃希菌(ATCC25922，南京便診生物科技有限公司)；蛋白酶K(71049-3，EMD Millipore)；核酸內切酶(XbaⅠ，TaKaRa)；脈沖場凝膠電泳λ Ladder DNA Marker購自Bio-Rad；限制性內切酶等常規PCR試劑購自TaKaRa公司；LB肉湯、Mueller-Hinton培養基及8種抗生素的E-test條均購自BioMerieux公司；其他常規試劑均為國產分析純，購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 主要方法

1.2.1 E-test實驗以E-test法測定8種抗生素的最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)，包括亞胺培南(Imipenem，IMI)、美羅培南(Meropenem，MEM)、頭孢哌酮(Cefoperazone，CFZ)、頭孢西丁(Cefoxitin,CFX)、頭孢他啶(Ceftazidime，CAZ)、頭孢吡肟(Cefepime，CFM)、環丙沙星(Ciprofloxacin，CPFX)和阿米卡星(Amikacin，AMK)。選取待測菌純菌落，制備成0.5麥氏單位的菌懸液，以無菌棉簽均勻的涂抹于MH培養皿，放置20 min，揮干水分，以E-test藥敏試紙條進行檢測。以大腸埃希菌ATCC25922作為質控菌株，以CLSI 2011標準為評定標準。

1.2.2 改良的Hodge試驗主要用于測定碳青霉烯酶表型，選取大腸埃希菌ATCC25922純菌落，制備成0.5麥氏單位的菌懸液，稀釋10倍，涂于MH培養皿，進行美洛培南藥敏紙片測定。以美洛培南藥敏紙片邊緣為起點，沿離心方向劃一直線，35°C培養過夜，抑菌圈內出現矢狀者為陽性。

1.2.3 脈沖場凝膠電泳(PFGE)實驗常規細菌接種、包埋，調整濁度為2～2.5 MacFarrand；并取300 μl菌液制備2%低熔點膠塊。蛋白酶K消化，50℃24 h，消化濃度0.8 mg/L。內切酶消化，體系：10×XbaⅠ內切酶緩沖液+BSA+10×XbaⅠ內切酶+超純水=12 μl+ 12 μl+4 μl+102 μl；37℃24 h。消化后以脈沖場凝膠電泳裝置電泳，紫外線凝膠成像儀拍照，分析條帶。

1.2.4 脈沖場凝膠電泳(PFGE)實驗多序列位點分型(MLST)實驗采用煮沸法提取細菌DNA模板，參照MLST專業網站設計管家基因引物(表1)。PCR體系：按照Taq酶說明書配比，含10×buffer、3.5 mmol Mg2+、2 mmol/L dNTPs、500 μmol/L引物、0.25 U Taq、10 ng模板，共計50 μl反應體系。PCR條件：94°C 5 min，94°C 50 s，50°C 30 s，72°C 50 s，30個循環；72°C 10 min。產物送至上海生工進行雙向測序，比對MLST序列型，并分析與PFGE分型的相似度。

表1 MLST 7對管家基因的引物序列

2 結果

2.1 各菌株的MIC檢測結果14株碳青霉烯類耐藥型肺炎克雷伯菌對常用碳青霉烯類抗生素IMI和MEM呈中高度耐藥，MIC分別為8～64 mg/L、16～128 mg/L；對常見頭孢類抗生素CFZ、CFX、CAZ和CFM均呈高度耐藥，MIC 32～256 mg/L；對喹諾酮類藥物CPFX呈中度耐藥，MIC 2～32 mg/L；對氨基糖苷類抗生素AMK不穩定，MIC＜0.12～256 mg/L，見表2。

表2 14株碳青霉烯類耐藥型肺炎克雷伯菌對臨床8種常用抗生素的MIC(mg/L)

2.2 各菌株的耐藥基因型檢測結果本組碳青霉烯類耐藥型KPC表型檢測均為陽性，均可擴增出KPC條帶，基因測序屬KPC-2型；此外，尚有13株擴增出SHV帶，7株TEM條帶及3株CTX帶。

2.3 各菌株的耐藥克隆型和序列型檢測結果PFGE分型顯示A克隆2株(14.3%)、B克隆9株 (64.3%)、C克隆3株(21.4%)，MLST分型顯示ST11 9株(64.3%)、ST15 4株(28.6%)、ST439 1株(7.14%)，分型結果基本一致；見圖1、圖2。

圖1 各株菌株的PFGE電泳圖譜

圖2 PFGE克隆型與MLST序列型的同源性分析圖

3 討論

KNP屬革蘭氏陰性桿菌，常見于呼吸道和腸道，近年其碳青霉烯類耐藥菌株有增多趨勢。據報道，產生KPC酶是KNP抵抗碳青霉烯類抗生素的主要原因之一[5]，其中，西歐國家的產酶率為10%～40%[6]，我國稍高，為20%～50%[7]。KPC酶系能夠水解亞胺培南或美羅培南的一類β-內酰胺酶，對幾乎所有β-內酰胺類抗生素如青霉素、頭孢菌素及碳青霉烯類等均有較高水解活性。且產KPC酶型菌株往往攜帶多種其他耐藥基因，可導致多種抗生素交叉耐藥現象，是限制臨床抗感染治療療效的重要因素之一[8]。目前，國外對于產生KPC酶KNP的基因學研究已較為深入；然而國內相對局限，個別產KPC酶菌株的報道多，基因型與同源性研究偏少。本研究自重癥監護病房分離產KPC酶KNP菌株14例，利用E-test法測定8種常見抗生素的MIC，以期為指導臨床合理用藥提供依據；同時，對該14種菌株的基因型、流行克隆型以及序列型也做初步探討，以期為其耐藥機制的深入研究提供依據。

流行病學調查結果顯示[9]，國內產KPC酶KNP以KPC-2基因型為主，本院自重癥監護病房分離碳青霉烯類耐受性KNP菌株14株，經鑒定均為KPC-2型，與以往多數報道相符。KPC-2酶最早報道于2002，與KPC-1酶有一個氨基酸的改變，分別屬于Ambler與Bush分類的A、2f組，其耐藥性不依賴于膜孔蛋白的丟失。研究表明[10]，KPC-2酶位于結合質粒的轉座子上，不僅可進行垂直傳播，尚有水平傳播給其他細菌的活性。本研究的藥敏性試驗結果顯示，KPC-2酶對除碳青霉烯類以外的其他常用抗生素亦有顯著耐藥性，且對頭孢類抗生素的耐藥性尤其偏高，本組四種頭孢抗生素中，MIC最低限為32 mg/L，部分菌株可達256 mg/L。此外，對喹諾酮類藥物CPFX呈中度耐藥，對氨基糖苷類抗生素AMK亦有一定的耐受作用。鑒于以上抗生素臨床應用的廣泛性和高密度性，克服以KPC-2基因型為主的KNP耐藥性已成為我國感染性疾病研究領域亟待解決的重要課題之一。

PFGE是目前國際上公認的病原菌同源性分析的“金標準”，建立在細菌染色體DNA的酶切片段長度多態性的基礎上，即通過DNA條帶圖譜對細菌進行克隆分型。MLST則是一直基于核酸序列的細菌分型方法，屬于分子水平流行病學監測研究的一種。PFGE和MLST的交叉研究利于從分子水平細化和明確其耐藥機制和流行病學指征。本研究結果顯示，本院KPC-2基因型KNP的主要流行克隆型為B型(9/14，64.3%)，主要流行序列型為ST11(9/14，64.3%)。與國外流行情況有些許出入，提示KPC-2基因型KNP的耐藥基因可能存在地域差異，應以地區為單位，開展更為全面的研究。

綜上所述，碳青霉烯類耐藥型肺炎克雷伯菌對部分其他種類的抗生素亦有較強耐藥性，KPC-2型碳青霉烯酶是本院肺炎克雷伯菌產生青霉烯類耐藥性的主要原因，主要流行克隆型為B型，主要流行序列型為ST11，應做重點研究。

[1]Orsi G,Bencardino A,Venditti M,et al.Patient risk factors for outer membrane permeability and KPC-producing carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolation:results of a double case-control study[J].Infection,2013,41(1):61-67.

[2]Correa L,Martino M,Marra A,et al.A hospital-based matched case-control study to identify clinical outcome and risk factors associated with carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae infection [J].BMC Infectious Diseases,2013,13(1):80.

[3]Zulfiqar S,Shakoori A.Molecular characterization,metal uptake and copper induced transcriptional activation of efflux determinants in copper resistant isolates of Klebsiella pneumoniae[J].Gene,2012, 510(1):32-38.

[4]Hussein K,Raz-Pasteur A,Kassis I,et al.Impact of carbapenem resistance on the outcome of patients'hospital-acquired bacteraemia caused by Klebsiella pneumoniae[J].The Journal of Hospital Infection,2013,83(4):307-313.

[5]湯瑾,李卿,蔣燕群.對肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的研究進展[J].檢驗醫學,2010,25(01):63-66.

[6]Fu Y,Zhang F,Liu S,et al.Differential expression of bla(SHV)related to susceptibility to ampicillin in Klebsiella pneumoniae[J].International Journal ofAntimicrobialAgents,2007,29(3):344-347.

[7]關紅,曹霞,陳蕊,等.對碳青霉烯類抗生素敏感性降低的肺炎克雷伯菌耐藥機理探討[J].四川大學學報(醫學版),2013,44 (02):242-245,250.

[8]蒯守剛,邵海楓,王衛萍,等.肺炎克雷伯菌介導碳青霉烯類耐藥的基因型檢測[J].臨床檢驗雜志,2008,26(05):358-361.

[9]吳丹丹,蔡加昌,劉進.耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的感染現狀[J].中國抗生素雜志,2011,36(01):1-6.

[10]周蓉,朱衛民.肺炎克雷伯菌分子流行病學及耐藥機制研究進展[J].國外醫藥(抗生素分冊),2012,33(01):1-5,42.

Genetic testing of carbapenems-resistant Klebsiella pneumoniae.

YU Qin-de1,XU Ping2,YU Yong-wen1,WANG

Shu-guang1,FENG Gui-mei1.
1.Department of Pharmacy,the Aerospace Hospital of Changsha,Changsha 410205, Hunan,CHINA;2.Department of Pharmacy,Xiangya Hospital of Central South University,Changsha 410205,Hunan, CHINA

ObjectiveTo analyze the antibiotic resistance and genotype of Klebsiella pneumoniae(KNP)resistant to carbapenems.Methods14 strains of Klebsiella pneumonia resistant to carbapenems were separated.The antibiotic resistance capacity,drug-resistant phenotype and genic sequence type were detected with E-test,reformative Hodge-test, pulsed-field gel electrophoresis(PFGE)and multilocus sequence typing(MLST).ResultsThe MICs of KNP to imipenem and meropenem were 8～64 mg/L and 16～128 mg/L respectively,with moderate to high antibiotic resistance capacity to carbapenems.The antibiotic resistance capacities to cefoperazone,cefoxitin,ceftazidime and cefepime were all high with MIC of 32～256 mg/L,and to ciprofloxacin it showed a moderate antibiotic resistance capacity with MIC of 3～32 mg/L,while to amikacin,it is unstable with MIC of 0.38～256 mg/L.All 14 stains of KNP could produce Klebsiella pneumoniae carbapenemase 2(KPC-2).PFGE results showed cloning types of A(n=2),B(n=9)and C(n=3).Meanwhile,MLST results showed ST types of ST11(n=9),ST15(n=4)and ST439(n=1).ConclusionCarbapenems-resistant KNP also resists to some other kinds of antibiotics,and KPC-2 is the primary cause of that resistance in our hospital,where the major epidemic cloning and sequence types are type B and type ST11 respectively

Klebsiella pneumoniae;Carbapenemases;Antibiotic;Drug resistance;Genetic testing

R378.99+6

A

1003—6350（2014）17—2499—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.17.0980

2014-02-25)

于親德。E-mail：wuzhichuang1971@163.com