辛伐他汀對大鼠成骨細胞經典Wnt信 號通路相關因子表達的影響

傅坤發，陸冰，劉曄，胡健，孔繁榮

（江蘇省老年醫院老年科，江蘇南京 210024）

·論著·

辛伐他汀對大鼠成骨細胞經典Wnt信 號通路相關因子表達的影響

傅坤發，陸冰，劉曄，胡健，孔繁榮

（江蘇省老年醫院老年科，江蘇南京 210024）

目的觀察不同濃度、不同時間辛伐他汀對體外培養的大鼠成骨細胞經典Wnt通路Wnt3a、LRP5和β-catenin的mRNA表達的影響，探討辛伐他汀抗骨質疏松的可能機制。方法用酶消化法培養大鼠顱骨成骨細胞，采用倒置相差顯微鏡及堿性磷酸酶染色和茜素紅染色觀察和鑒定成骨細胞。用濃度分別為10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L的辛伐他汀干預大鼠成骨細胞24 h、48 h和72 h，并設無辛伐他汀為對照組，采用RT-PCR檢測經典Wnt信號通路Wnt3a、LRP5和β-catenin的mRNA表達情況。結果鏡下觀察及染色結果均顯示具有成骨細胞典型特征。RT-PCR結果顯示：10-5mol/L辛伐他汀組干預24 h后較對照組Wnt3a[(2.09±0.12)vs (1.82±0.09)]、LRP5[(1.42±0.07)vs(1.29±0.07)]和β-catenin[(1.10±0.06)vs(0.95±0.06)]的mRNA表達顯著增加；干預48 h和72 h后各組Wnt3a(F=37.78和96.52，P=0.000)、LRP5(F=10.32，P=0.001和F=22.02，P=0.000）的mRNA表達隨著辛伐他汀濃度的增大而顯著增加，β-catenin的mRNA表達較對照組顯著增加(F=6.67和21.90，P＜0.05)；10-8～10-5mol/L辛伐他汀各組中分別干預24 h、48 h和72 h，隨著干預時間延長Wnt3a和LRP5的mRNA表達均增加；干預48 h與24 h比較，β-catenin的mRNA表達差異無統計學意義[(1.08±0.09)vs(1.02±0.06)，P＞0.05]，而干預72 h較24 h顯著增加[(1.23±0.10)vs(1.02±0.06)，P＜0.05]，且辛伐他汀濃度為10-6mol/L和10-5mol/L干預72 h較48 h顯著增加[(1.32±0.07)vs(1.11±0.05)和(1.47±0.08)vs(1.19±0.04)，P＜0.05]。結論辛伐他汀可促進體外培養大鼠成骨細胞經典Wnt信號通路Wnt3a、LRP5和β-catenin的mRNA表達。

辛伐他汀；成骨細胞；經典Wnt信號通路；骨質疏松

骨質疏松癥(Osteoporosis，OP)已經成為嚴重威脅老年人健康的一種疾病，迄今為止OP的發病機制尚未完全闡明。近年來發現經典Wnt信號通路在成骨細胞的發育及分化過程中扮演重要角色，已成為骨質疏松領域的研究熱點。目前治療OP的藥物大部分集中在靶向破骨細胞，以抑制骨吸收為主，促進成骨有限。研究表明他汀類藥物可通過多種途徑刺激體外培養的成骨細胞增殖和分化，促進骨合成代謝作用，但其機制仍在研究中。本研究通過觀察不同濃度辛伐他汀對體外培養大鼠顱骨成骨細胞經典Wnt信號通路的主要因子Wnt3a、LRP5和β-catenin的mRNA表達的影響，探討他汀類藥物影響骨代謝的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 出生24 h內的SD大鼠6只，購自東南大學實驗動物中心，辛伐他汀(Simvastatin，SIM，杭州默沙東公司)，低糖DMEM培養基(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物公司)，0.25%胰酶(加EDTA)(Sigma公司)，Ⅱ型膠原酶(Gibco公司)，Trizol RNA提取試劑盒(Gibco公司)，PCR試劑盒(大連寶生物)，堿性磷酸酶染色試劑盒(南京建成生物工程研究所)，其他試劑均為國產分析純。

1.2 成骨細胞的分離與培養 將新生24 h內的SD大鼠放入75%酒精中浸泡消毒10 min，無菌操作取出顱蓋骨，置于4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)的培養皿中，清除骨膜、血管及結締組織，并用PBS液洗滌。將洗凈的顱蓋骨剪成1 mm×1 mm大小的骨片，用0.25%胰酶37℃消化20 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，再加入0.1%Ⅱ型膠原酶37℃消化1 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入5 ml含10%新生小牛血清的DMEN培養液，吹打均勻，接種于培養瓶中，培養瓶置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，24 h后觀察細胞并換液，以后每3 d換液1次，細胞融合后，用0.25%胰蛋白酶消化，以1:1的方式將細胞傳代，接種于另一培養瓶繼續培養，取第3代細胞進行實驗。

1.3 成骨細胞的鑒定 采用倒置相差顯微鏡(Olympus公司)觀察培養細胞的一般形態及生長情況；采用Gomori鈣鈷法行堿性磷酸酶染色，嚴格按試劑盒說明書操作；細胞培養3周，采用茜素紅染色觀察礦化結節。

1.4 不同濃度辛伐他汀干預成骨細胞 細胞以2×104個/cm2密度加入25 cm2培養瓶中，24 h后換含濃度分別為10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L的辛伐他汀培養基，并設不含辛伐他汀的培養基為對照組，分別于24 h、48 h和72 h后采用Trizol法分別提取總RNA。

1.5 經典Wnt信號通路相關因子mRNA檢測 培養結束后采用Trizol一步法提取各組細胞總RNA，按試劑盒說明操作。總RNA經電泳顯示28S、18S和5S三個條帶，RNA的完整性通過28S：18S判斷，于紫外分光光度計下讀取OD260/OD280的比值作為RNA的純度。定量后取2 μg，M-MLV逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，參照說明書進行操作。取逆轉錄產物1 μl為模板進行PCR擴增，反應體系20 μl。根據目的基因在Gene Bank中的已知序列，設計引物(上海捷倍思基因技術有限公司)。經典Wnt信號通路相關基因Wnt3a：上游引物5'-CATCGCCAGTCACATGCACC-3'，下游引物5'-CGTCTATGCCATGCGAGCTCA-3'；LRP5：上游引物5'-GACATTTACTGGCCCAATGG-3'，下游引物5'-CTGCCCTCCACCACCTTCT-3'；β-catenin：上游引物5'-GATTTGATGGAGTTGGACATGG-3'，下游引物5'-TGTTCTTGAGTGAAGGACTGAG-3'；內參照β-actin：上游引物5'-GGCATCGTGATGGACTCCG-3'，下游引物5'-CGTGGAAGGTGGACAGCGA-3'。反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，共35個循環。最后一個循環72℃延伸8 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用ImageMaster VDS圖像分析儀進行掃描，用Total Lab圖像分析軟件分析所得圖譜。

1.6 統計學方法 所有實驗結果均重復3次，數據以均數±標準差()表示。采用SPSS15.0軟件進行統計學處理，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠顱骨成骨細胞的鑒定結果 倒置相差顯微鏡下見培養的大鼠顱骨細胞有典型的成骨細胞特征，細胞貼壁生長，形狀多為三角形、多邊形、長梭形，以單核為主，有較多突起(見圖1A)；經Gomori鈣鈷法染色后見胞質中呈現灰黑色顆粒或塊狀沉淀(見圖1B)；鈣化結節染色后可見橘紅色的礦化結節形成(見圖1C)。

圖1 體外培養的大鼠成骨細胞形態及染色結果

2.2 辛伐他汀干預對大鼠成骨細胞經典Wnt相關因子mRNA的影響 本研究所提取得總的RNA其吸光度值OD260/OD280在1.8～2.0之間，提示純度較好；其熒光強度比RNA 28S:18S=2:1，且條帶無彌散現象，提示RNA完整、無降解。

2.2.1 不同濃度辛伐他汀對于大鼠成骨細胞經典Wnt信號通路的影響 不同濃度辛伐他汀干預體外培養的大鼠成骨細胞24 h后，與對照組比較，10-5mol/L組Wnt3a[(2.09±0.12)vs(1.82±0.09)]、LRP5 [(1.42±0.07)vs(1.29±0.07)]和β-catenin[(1.10±0.06) vs(0.95±0.06)]的mRNA表達顯著增加(P值分別為0.007、0.04和0.006)，其余濃度辛伐他汀組Wnt3a、LRP5和β-catenin的mRNA表達差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。不同濃度辛伐他汀干預體外培養的大鼠成骨細胞48 h和72 h后，與對照組比較，10-8～10-5mol/L各組Wnt3a、LRP5和β-catenin的mRNA表達均顯著增加，且隨著辛伐他汀濃度增大mRNA表達增多，除了β-catenin外(P＜0.05)，見表2、表3。

表1 不同濃度辛伐他汀干預24 h對大鼠成骨細胞經典Wnt信號通路的影響（，n=3）

表1 不同濃度辛伐他汀干預24 h對大鼠成骨細胞經典Wnt信號通路的影響（，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05

2.2.2 辛伐他汀干預時間不同對于大鼠成骨細胞經典Wnt信號通路的影響 辛伐他汀濃度為10-8～10-5mol/L各組中分別干預24 h、48 h和72 h，隨著干預時間延長Wnt3a和LRP5的mRNA表達增加(各濃度組Wnt3a和LRP5統計結果分別為F=24.73，P=0.01和F=10.45，P=0.01；F=38.95，P=0.000和P=18.75，P= 0.003；F=83.06，P=0.000和F=28.41，P=0.001；F= 85.42，P=0.000和P=29.15，P=0.001)；干預48 h與24 h比較，β-catenin的mRNA表達差異無統計學意義[(1.08±0.09)vs(1.02±0.06)，P＞0.05]，而干預72 h較24 h均顯著增加[(1.23±0.10)vs(1.02±0.06)，P＜0.05]，且辛伐他汀濃度為10-6mol/L和10-5mol/L干預72 h較48 h顯著增加[(1.32±0.07)vs(1.11±0.05)和(1.47±0.08)vs(1.19±0.04)，P＜0.05]，見圖2。

表2 不同濃度辛伐他汀干預48 h對大鼠成骨細胞經典Wnt信號通路的影響(，n=3)

表2 不同濃度辛伐他汀干預48 h對大鼠成骨細胞經典Wnt信號通路的影響(，n=3)

表3 不同濃度辛伐他汀干預72 h對大鼠成骨細胞經典Wnt信號通路的影響（，n=3）

表3 不同濃度辛伐他汀干預72 h對大鼠成骨細胞經典Wnt信號通路的影響（，n=3）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與相鄰低濃度組比較，bP＜0.05

組別對照組10-8mol/L SIM 10-7mol/L SIM 10-6mol/L SIM 10-5mol/L SIM F值P值Wnt3a/β-actin 1.98±0.07 2.36±0.09a2.53±0.06ab2.68±0.06ab3.05±0.06ab96.52 0.000 LRP5/β-actin 1.38±0.06 1.55±0.08a1.69±0.07ab1.76±0.08a1.93±0.08ab22.02 0.000 β-catenin/β-actin 1.00±0.05 1.14±0.06a1.22±0.07a1.32±0.07a1.47±0.08ab21.90 0.000

圖2 不同濃度辛伐他汀不同的干預時間對大鼠成骨細胞經典Wnt信號通路的影響

3 討論

骨質疏松(OP)的發生是成骨細胞和破骨細胞平衡失調引起的，即骨吸收超過了骨形成，涉及激素、細胞因子、機械應力等多方面因素，迄今為止OP的發病機制尚未完全闡明，近年來，研究發現經典Wnt信號通路在骨代謝過程中具有重要意義。經典Wnt信號通路是Wnt蛋白與其受體卷曲蛋白(Frz)和輔助受體LRP5/6結合形成復合物，然后Frz作用于胞質內的蓬松蛋白(Dvl-1)，Dvl-1使糖原合成GSK-3β，抑制β-catenin的降解，使胞質內β-catenin累積并轉入細胞核，與T細胞因子(TCF/LEF)相互作用激活靶基因轉錄，調節成骨細胞活性[1-2]。Shahnazari等[3]研究表明，在骨形成和骨代謝過程中Wnt/β-catenin信號通路發揮著極其重要的調控作用。Day等[4]發現經典Wnt信號通路激活可以促進成骨細胞的形成，并且在軟骨形成過程中促進成骨細胞的分化。Hill等[5]發現阻斷間質中Wnt/β-catenin信號通路后，會減少成骨細胞的分化和影響骨骼的發育。

他汀類調脂藥(Statins)是3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)抑制劑，除了具有降低膽固醇、保護內皮功能、抗炎、抗氧化等多效性外，近年來發現他汀還具有激活成骨細胞、促進成骨細胞增殖、增加骨形成的作用，他汀在骨質疏松方面的研究成為了當前的熱點。最早發現他汀具有促進成骨作用是在1999年，Mundy等[6]通過體外實驗首先發現他汀類藥物可以增加骨形態發生蛋白2(BMP-2)mRNA的表達，說明其具有激活成骨細胞，促進骨合成代謝的作用。后來的臨床研究也證實他汀類藥物可降低骨折風險[7]，增加骨密度[8]。但是其作用機制目前尚未完全闡明。有兩項研究顯示辛伐他汀在增加大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)[9]和胚胎干細胞(ESCs)[10]向成骨細胞分化過程中，會出現Wnt信號通路相關因子水平增高。本研究表明辛伐他汀干預體外培養的大鼠成骨細胞可促進其經典Wnt信號通路中Wnt3a、LRP5和 β-catenin的mRNA表達，并且總體趨勢是呈濃度和時間依賴的，即辛伐他汀濃度越大，干預時間越長，促進上述基因表達越明顯，尤其是Wnt3a和LRP5。由于激活經典Wnt信號通路可以促進成骨細胞活性和骨形成，本研究發現辛伐他汀可以促進成骨細胞經典Wnt信號通路主要因子的基因表達，其機制可能與他汀類藥物激活成骨細胞經典Wnt信號通路有關，但由于本研究僅為mRNA水平檢測，尚待進一步研究。

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Effect of simvastatin on the related factors in expression of canonical Wnt signaling pathway in osteoblasts of rats.

FU Kun-fa,LU Bing,LIU Ye,HU Jian,KONG Fan-rong.
Department of Geriatrics,Jiangsu Province Geriatric Hospital,Nanjing 210024,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of different concentrations,multi-treatment course of simvastatin on the mRNA expression of Wnt3a,LRP5 and β-catenin in osteoblasts of rats and the potential mechanism. MethodsOsteoblasts were obtained from calvaria.Morphology of osteoblasts was observed under phase contrast microscope after ALP staining and Alizarin red staining.Rat osteoblasts were treated by different concentrations of simvastatin(10-8mol/L,10-7mol/L,10-6mol/L and 10-5mol/L),and Wnt3a,LRP5 and β-catenin mRNAexpression were detected using RT-PCR after 24 h,48 h and 72 h.ResultsThe cultured cells had the typical features of osteoblasts.Comparedwith that in control group,the result of RT-PCR showed that the expression of Wnt3a[(2.09±0.12)vs(1.82±0.09)],LRP5 [(1.42±0.07)vs(1.29±0.07)]and β-catenin[(1.10±0.06)vs(0.95±0.06)]mRNA in 10-5mol/L simvastatin group treated after 24 h,and those of Wnt3a(F=37.78 and 96.52,P=0.000)and LRP5(F=10.32,P=0.001 and F=22.02,P=0.000) increased significantly with the increase of concentration of simvastatin in each group treated after 48 h and 72 h(P＜0.05).After 24 h,48 h and 72 h intervention,the expression of Wnt3a and LRP5 mRNA increased significantly in each group as the intervention time got longer.In group 10-6mol/L and 10-5mol/L,compared with that after simvastatin intervention 48 h,β-catenin mRNA expression increased significantly after 72 h[(1.32±0.07)vs(1.11±0.05)and (1.47±0.08)vs(1.19±0.04),P＜0.05].ConclusionSimvastatin could promote Wnt3a,LRP5 and β-catenin mRNA gene's expression of canonical Wnt signaling pathway in osteoblast of rats.

Simvastatin;Osteoblasts;Canonical Wnt signaling pathway;Osteoporosis

R-332

A

1003—6350（2014）22—3286—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.22.1290

2014-06-12)

傅坤發。E-mail：fukunfa@hotmail.com