去細胞神經支架聯合VEGF 修復周圍神經缺損的實驗研究

潘富文，吳林清

(海南省農墾三亞醫院骨科，海南三亞 572000)

·論著·

去細胞神經支架聯合VEGF 修復周圍神經缺損的實驗研究

潘富文，吳林清

(海南省農墾三亞醫院骨科，海南三亞 572000)

目的觀察去細胞神經支架聯合血管內皮生長因子(VEGF)在促進周圍神經損傷修復中的作用。方法購買雄性Wistar大鼠60只，先取15只成年Wistar大鼠作為神經供體，制備去細胞神經支架，將制備好的神經支架剪取長度約為1 cm的去細胞神經基膜管。根據實驗要求，將余Wistar大鼠隨機分為三組，每組大鼠均15只。實驗組(A組)為去細胞神經支架移植+局部注射VEGF組；對照組Ⅰ(B組)為去細胞神經支架移植組；對照組Ⅱ(C組)為自體神經移植組。術后喂養1個月，并每日觀察大鼠步態、患足潰瘍恢復情況。術后1個月取移植段坐骨神經組織行HE染色、免疫組化染色觀察再生神經S-100及軸突數量，髓鞘、神經纖維數等生長情況。結果術后1個月，三組大鼠的足部潰瘍、步態均有不同程度的恢復，其中實驗組恢復率接近于自體神經移植組，明顯優于單純去細胞神經支架移植組；A組的再生神經軸突數為(125.34±5.67)，B組再生神經軸突數為(62.32±3.71)，C組再生神經軸突數為(132.55±7.48)，A組與C組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，A組與B組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。結論去細胞神經支架聯合VEGF在促進周圍神經損傷修復過程中可能具有一定的作用。

神經修復；神經支架；周圍神經；化學去細胞

周圍神經損傷是手足顯微外科的常見病、多發病，其損傷后修復一直以來是治療的難點。即使患者經過較為科學的治療，患肢功能得到了較大程度的恢復，但仍然留下不同程度的后遺癥，給患者日后的正常生活帶來巨大的不便。因此，提高周圍神經損傷的診斷及治療，恢復其功能，提高生活質量已成為臨床醫師研究和關注的焦點[1]。隨著現代醫學組織工程學研究的深入發展，許多學者已經意識到一些材料、生長因子及細胞在神經修復過程中發揮著一定的作用。血管內皮生長因子(VEGF)作為血管生成微肽類蛋白，可以促進血管的再生，增加血管壁的通透性，能通過改善微循環間接地起到神經保護作用，同時也可以作為一種神經營養因子對神經系統起到維持與保護的作用[2-3]，而去細胞神經支架具有良好的完整性，組織相容性及生物力學穩定性。筆者為此將二者聯合應用于大鼠周圍神經損傷的治療中，以探討該組織工程神經在神經修復中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性Wistar大鼠60只(海南醫學院動物飼養中心提供)，體重(250±25)g，選取45只隨機分為A、B、C三組，每組15只；另外15只作為坐骨神經供體。

1.1.2 主要試劑與材料 VEGF(30 μg/ml)溶液購自武漢博士德生物技術有限公司，曲拉通100 (Triton-100)購自北京翰譜醫藥生物研究所，脫氧膽酸鈉購自北京博奧森生物技術有限公司，免疫組織化學染色超敏試劑盒(S-P超敏試劑盒鼠/兔)購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2 方法 A組為實驗組，采用去細胞神經支架移植+局部注射VEGF治療，B組僅采用去細胞神經支架移植組，C組僅采用自體神經移植。先用10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)腹腔注射，麻醉成功，取大腿后側入路，直視下依次切開皮膚，皮下，分離肌肉，顯露坐骨神經，在放大10倍的手術顯微鏡下，分別對三組大鼠組進行造模。用10-0顯微縫線，等間距縫合神經外膜，術后在實驗室條件下飼養大鼠1個月，術后A組每日按時在臀大肌注射濃度為VEGF(30μg/ml)[4]的液體5 ml，并觀察、記錄大鼠的步態、傷口愈合、足底潰瘍愈合等情況，并行組織形態學觀察。

1.3 HE染色 切取厚度為4～5 μm的石蠟切片，并烤干(時間約為2 h)。①脫蠟：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各放置10 min；②脫水：無水乙醇梯度脫水后置于蒸餾水洗3～5 min。③染色：染色、返藍各2 min。④水洗：再次用梯度乙醇水洗脫水。⑤封片：光鏡下觀察。

1.4 免疫組化染色①切片脫蠟至用磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.01 mol/L，pH 7.4)沖洗3次，每次3 min。②進行組織抗原相關修復。③每張切片滴加1滴過氧化酶阻斷溶液(試劑A)，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min。④除去PBS液，每張切片滴加1滴正常非免疫動物血清(試劑B)，室溫下孵育10 min。⑤除去血清，每張切片滴加1滴的第一抗體(S-100)，2 h后用PBS沖洗3次，每次3～5 min。⑥除去PBS液，每張切片滴加1滴生物素標記的第二抗體(試劑C)，室溫下孵育10 min。PBS沖洗3次，每次3 min。⑦除去PBS液，每張切片滴加1滴鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10 min。PBS沖洗3次，每次3 min。⑧除去PBS液，每張切片滴加2滴新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10 min，顯色合適后即刻進行先一步。⑨自來水沖洗，蘇木素復染，自來水沖洗返藍，梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封固。

1.5 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差()表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察結果 術后4周，A組與C組大鼠足部紅腫及潰瘍基本完全愈合，步態基本恢復正常，雙后足能站立。B組恢復相對較差，仍有7只患足潰瘍未愈。取材行組織學觀察時見各組移植神經組織輕度粘連，A組、C組神經移植物表面毛細血管網清晰可見，移植物近端稍稍膨大，遠端塌陷較輕，神經移植物的連續性及結構的完整性較為良好，而B組移植物塌陷相對較為嚴重，見圖1～圖4。

2.2組織學HE染色結果術后4周，A、C組再生雪旺細胞數量較多，神經纖維束呈圓形或橢圓形，整齊排列。纖維束周邊有大量的新生毛細血管，A組與C組有髓神經纖維數量多，髓鞘及軸突清晰可見，排列整齊，密度均勻，髓鞘厚度均一，明顯優于B組，見圖5～圖7。

2.3 組織學免疫組化染色結果術后4周，S-100蛋白縱、橫切片染色均呈棕黃色，A組、C組切片著色均勻、基本一致，雪旺細胞數量較多，排列整齊，僅僅環繞于神經鞘管周圍，細胞大小基本一致。而B組切片著色較淡，雪旺細胞數量相對較少，細胞大小形態不一，雪旺細胞排列較疏松，見圖8～圖10。

2.4 圖像分析結果術后4周，A、B、C組再生神經纖維數量、軸突數比較，A組和C組均優于B組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，而A組和C組兩組間比較差異則無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 術后4周各組再生神經纖維數、軸突數比較（n=15，，只/HP)

表1 術后4周各組再生神經纖維數、軸突數比較（n=15，，只/HP)

注：與A組比較，aP＜0.05，bP＞0.05；cP＜0.05，dP＞0.05。

3 討論

一直以來自體神經移植都被認為是神經修復的最佳方法，該方法猶如拆西墻補東墻，也存在問題，如供區皮膚感覺障礙、神經痛、瘢痕形成等。周圍神經組織工程研究包括神經支架、生長因子、細胞及兩者或者三者相互作用。去細胞神經具備神經再生的天然三維結構及細胞外基質，免疫原性低，具有良好的應用前景[5]。雪旺細胞作為周圍神經組織工程的種子細胞能分泌多種神經營養因子、細胞外基質，其在周圍神經再生中的重要作用已被廣泛證實[6]。VEGF可促進移植物的毛細血管生成，為雪旺細胞的存活，神經元、軸突長時間存活提供了較為理想的基礎環境，作為一種神經保護因子，可直接或者間接地促進神經元、軸突及髓鞘等生長，促進軸突再生，啟動并激活雪旺細胞延伸、增殖與分化，進而促進神經的再生修復[2，7]。之前許多學者研究已經證實，組織工程神經具有存進神經修復的作用。本實驗借鑒他人的研究經驗，將去細胞神經支架移植于大鼠坐骨神經缺損處，實驗組外加注射VEGF。結果顯示，神經支架移植+局部注射VEGF組，在步態恢復、足部潰瘍的恢復上明顯優于單純神經支架移植組，接近于自體神經移植組。說明去細胞神經支架聯合VEGF具有促進周為神經修復再生的作用。

本實驗引入的是同種異體去細胞神經支架，該神經支架具有免疫原性低、組織相容性、穩定性、三維仿生性等。為神經修復再生營造一個相對穩定的再生微環境及營養物質交換的場所，為雪旺細胞再生、軸突再生、神經纖維束植入奠定良好的基礎。近年來研究表明，VEGF可以促進神經微小血管的生成，同時也具有營養神經的作用，可被視為一種神經營養因子?？梢源龠M施旺細胞增生，神經軸突突起的長度，促進神經損傷后的再生及功能恢復[8]。在神經導管內加入VEGF，可以提高神經移植修復的療效，并且VEGF對某些代謝毒素引起的神經損害具有一定的逆轉及保護作用[9-10]。Pereira Lopes等[11]在實驗研究中實驗組引入了VEGF治療SD大鼠坐骨神經缺損，對照組單純注射等劑量的生理鹽水，實驗結果證實，實驗組神經修復效果明顯優于對照組。本實驗術后4周，行組織形態學觀察，神經支架移植+局部注射VEGF組和自體神經移植組再生雪旺細胞數量較多，神經纖維束呈圓形或橢圓形，整齊排列。纖維束周邊有大量的新生毛細血管，神經支架移植+局部注射VEGF組和自體神經移植組有髓神經纖維數量多，髓鞘及軸突清晰可見，排列整齊，密度均勻，髓鞘厚度均一，明顯優于單純神經支架移植組。S-100蛋白縱、橫切片染色均呈棕黃色，神經支架移植+局部注射VEGF組和自體神經移植組雪旺細胞數量較多，排列整齊，僅僅環繞于神經鞘管周圍，細胞大小基本一致。而單純神經支架移植組雪旺細胞數量相對較少，細胞大小形態不一，雪旺細胞排列較疏松。結果與許多學者的研究結果不謀而合。說明神經支架移植+局部注射VEGF具有一定的促進神經雪旺細胞增殖、分化以及促進神經修復的作用。

周圍神經損傷后在修復過程中，雪旺細胞的增殖與分化起著決定性的作用，雪旺細胞在增殖的過程中分泌各種神經營養因子，而它們會正反饋的促進雪旺細胞圍繞著神經微絲外圍生長，形成髓鞘，進而為神經微絲、微管及軸突的延伸營造了良好的環境。本實驗術后4周，組織形態學結果較好的詮釋了大體觀察大鼠步態、足部潰瘍的恢復情況。但依然存在一些諸如神經支架遠端的塌陷是否影響神經軸突的再生等問題，這些問題仍有待于日后的研究逐步解決。

[1]吳林清,殷超,王繼宏,等.周圍神經損傷后修復再生的研究進展[J/D].中華臨床醫師雜志(電子版),2014,8(7):1338-1341.

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[6]蔣良福,勞杰,何繼銀,等.幾丁糖膠原復合膜及激活態雪旺細胞修復周圍神經缺損的實驗研究[J].中華手外科雜志,2005,21 (3):172-174．

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Experimental research of acelluar nerve scaffold in combination with VEGF in the treatment of peripheral nerve defect.

PAN Fu-wen,WU Lin-qing.Department of Orthopedics,Sanya Land Reclamation Hospital,Sanya 572000,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of VEGF in combination with acellular nerve scaffold on repairing peripheral nerve defect.MethodsSixty male Wistar rats were bought,15 of which were selected as nerve donors.The acellular nerve scaffolds were prepared and then cut into 1 cm acellular nerve basal laminas.According to experimental design,the rest 45 rats were randomly divided into three groups,with 15 in each group.Group A(the experimental group)was treated with both VEGF and acellular nerve scaffolds transplantation,group B(control groupⅠ) with just acellular nerve scaffolds transplantation,group C(control groupⅡ)with nerve autograft.After surgery,the recovery of the rats'gait and plantar ulcer were observed every day.After one month of the surgery,the regenerative nerves'S-100 protein,number of axon,growth of myelin sheath and nerve fiber were observed by HE staining and immunohistochemical staining of the transplanted sciatic nerve tissue.ResultsOne month after the surgery,the three groups showed different recovery levels of the rats'gait and plantar ulcer.The recovery rate of group A was close to that of group C,but significantly higher than that of group B.The number of regenerative nerve axon of group A,B and C was(125.34±5.67),(62.32±3.71),and(132.55±7.48),respectively.They were no statistically significant difference between groupAand group C(P＞0.05),while the difference between groupAand group B was statistically significant(P＜0.05).ConclusionVEGF in combination with allogenic acellular nerve can help repairing peripheral nerve defect.

Nerve repair;Nerve scaffold;Peripheral nerve;Chemically acellular

R-332

A

1003—6350（2014）22—3283—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.22.1289

2014-09-06)

潘富文。E-mail：724269424@qq.com