利用米曲霉轉化谷氨酸鈉生成γ—氨基丁酸的研究

【關鍵詞】米曲霉轉化谷氨酸鈉；γ-氨基丁酸；研究

639文章編號：1004-7484（2014）-06-3504-03

米曲霉是一種安全有益的菌種，利用米曲霉轉化MSG（谷氨酸鈉，以下簡稱MSG）生成GABA（γ-氨基丁酸，以下簡稱GABA）能提高制作GABA的安全性，達到食用級。

1米曲霉生成顆粒型的米曲霉菌球方法

1.1米曲霉菌球活化從保存培養基菌種中接種于平面培養基上進行活化，恒溫箱中培養3天。之后，接種3環于200mL培養基（500mL三角瓶），于28℃、160r/min搖床中培養2天。

1.2米曲霉菌球酶活的測定取1g米曲霉菌球加入到50mL含1%MSG的醋酸-醋酸鹽緩沖液（0.2mol/LpH4.6）中，37℃、140r/min搖床反應2h。0.22μm微濾膜過濾后，收集過濾液，測定GABA含量，計算酶活。

酶活U：在37℃，140rpm的搖床中反應1h，轉化生成1μmol GABA的酶量。

1.3菌體生長與產酶關系的研究將活化后的米曲霉2%（v/v）轉接到200mL發酵培養基中，共16瓶，每12h取出2瓶作為研究，濾紙過濾收集菌球，測定菌球濕重和酶活。以時間為橫坐標，菌球的酶活和菌體濕重為縱坐標，繪制菌體生長與產酶關系圖。

1.4米曲霉菌球的最適pH配制50mL不同pH濃度梯度的0.2mol/L醋酸鈉緩沖液（pH3.5-5.6，1%MSG），往中加入1g米曲霉菌球，37℃、140rpm下反應2h取樣測定GABA含量，計算酶活，以最高的酶活力為參比計算相對酶活。

1.5米曲霉菌球的pH穩定性稱取1g菌球加入至7mL不同pH的醋酸緩沖液中，室溫下保存2h后，于冷凍離心機中4℃、5000rpm離心10min，收集菌球。之后，加入到50mL含1%MSG的醋酸-醋酸鹽緩沖液（pH4.6），測定酶活，以最高的酶活為參比計算相對酶活。

1.6米曲霉菌球的最適溫度分別在30，40，50和60℃不同溫度下，加入1g米曲霉菌球，37℃、140rpm下反應2h取樣測定GABA含量，計算酶活，以最高的酶活力為參比計算相對酶活。

1.7米曲霉菌球的溫度穩定性稱取1g菌球加入至50mL醋酸鹽緩沖液（0.2mol/LpH4.6）中，分別在30℃，40℃，50℃和60℃不同溫度下保存2h。之后，往中加入1%MSG，37℃、140rpm的搖床中反應2h，測定酶活，以最高的酶活為參比計算相對酶活。

1.8化學物質對米曲霉菌球酶活的影響分別在50mL醋酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH4.6，1%MSG）中加入CaCl2，FeCl3，KCl，KI，MgSO4，MnSO4，配置成含有1mM離子的緩沖液，測定這些離子對酶活的影響，以不添加以上化學物質的酶活為參比計算相對酶活。

1.9米曲霉菌球米氏常數及最大反應速率配制不同濃度谷氨酸鈉的酶反應液體系（50-250mM），加入菌球1g，于37℃、140rpm搖床反應1h，測定各反應液中GABA含量，計算酶反應速度，并以1/v-v/[S]作圖，其縱軸截距為1/Vmax，橫軸上的截距為-1/Km。

1.10產物的生成與反應時間的關系在最適pH條件，同一反應體系下，以2g菌球/100mL反應體系的比例加入菌球，在不同的時間取樣500μL測定反應產物GABA的生成量，以GABA含量為縱坐標，時間為橫坐標繪制曲線。

1.11GABA定性檢測在電熱條件下，氨基酸與展層劑中的茚三酮反應可以生成特異性的有色物質，并根據GABA和MSG標準品在層析紙的位置，確定樣品中是否含有GABA和MSG。該方法的主要特點是省時、便捷、經濟、準確，適合定性研究氨基酸。其具體步驟如下：

展層劑的配制：組成為正丁醇：冰醋酸：去離子水=4：2：1，混合均勻，并加入0.4%的茚三酮充分溶解，避光密封放置于層析缸中備用。

準確量取2μL溶液點樣于Whatman1號層析濾紙上，在層析缸中上行層析2h，吹干展開劑后于65℃烘箱中顯色30min，即可得到紙譜圖。

2米曲霉菌球酶學性質研究

2.1米曲霉菌球形態米曲霉菌球顆粒分明，形態以圓形為主。這些菌球的直徑大約在2-5mm左右，與海藻酸鈉固定化酶顆粒較為相似，具有易過濾的特性。

2.2GABA的定性測定。

條帶1、2和3分別為米曲霉菌球反應液、標準對比液和米曲霉的發酵液。隨著層析液的流動，氨基酸由于分子量不同，在層析紙上的流速不同，展現的位置也不一樣，可以定性地確定不同種類的氨基酸。從圖1中可知，條帶3中沒有GABA斑點，原因是發酵液的pH在6.5左右，不在菌球適宜pH范圍內，抑制了菌球的酶活。然而，菌球催化反應體系中卻有GABA，原因是反應液的pH4.8在米曲霉菌球的適宜pH范圍內。以上結果表明，米曲霉菌球在適宜的pH條件下可以催化反應液，轉化MSG成GABA。