聚合酶鏈反應檢測腫瘤細胞P16基因缺失及其臨床意義

【摘要】目的探討P16基因缺失與腫瘤的關系。方法用聚合酶鏈反應技術，檢測56例肝癌、25例白血病患者的P16基因缺失情況。結果56例肝癌患者中有13例P16基因缺失，25例白血病患者中有8例P16基因缺失，缺失率分別為23.2%，32.0%。結論P16基因缺失與腫瘤的發生關系密切，檢測P16基因缺失有助于腫瘤的輔助診斷。

【關鍵詞】P16基因；聚合酶鏈反應；腫瘤；基因缺失

100文章編號：1004-7484（2014）-06-3085-02

腫瘤的發生發展與多種遺傳基因改變有關，P16基因又稱MTS1或CDK4I，位于人類第九號染色體短臂（9P21）上，全長8.5kb，由三個外顯子和兩個內含子組成，其編碼16KD產物即P16蛋白。MST1作為CDK4的抑制因子，抑制細胞的分裂，增殖。

1資料與方法

1.1標本

1.1.156例肝癌標本來自新沂市第二人民醫院病理科肝癌標本已經脫水石蠟包埋。31例肝硬化標本來自新沂市第二人民醫院外科。

1.1.225例白血病標本來自新沂市人民醫院血液科20例正常對照組來自健康體檢者。

1.2DNA提取①石蠟包埋的肝癌標本：把標本切碎置離心管中，二甲苯脫蠟，12000r/min離心4min，吸取上清夜，加入無水乙醇，混勻離心，吸去乙醇，開蓋靜置5min，讓乙醇揮發；加入蛋白酶K緩沖液，55°C3h，7000r/min離心5min，95°C8min滅活蛋白酶K，離心后取上清液作反應模板。肝硬化標本切碎后直接加蛋白酶K緩沖液，以下操作同前。②白血病細胞標本：白血病經骨髓片檢查確診。取抗凝血200ul，加500ul溶胞液，冰浴10min，5000r/min離心10min，去盡上清液，沉淀內加入500ul溶胞液，混勻，冰浴10min，去盡上清，沉淀內加入裂解酶60ul，混勻，100Cmin，8000r/min離心5min，取上清液于另一管內加處理液5ul，再加入250ul無水乙醇，倒轉幾次，12000r/min離心5min，去盡上清液，開蓋靜置5min，加入20ul雙蒸水溶解沉淀，作為反應模板。

2結果

2.156例肝癌標本中有13例P16基因缺失缺失率為23.2%；而31例肝硬化標本中僅有1例P16基因缺失，缺失率為3.2%。

2.225例白血病標本中有8例P16基因缺失缺失率為32%，而20例正常對照者則未發現P16基因缺失。

3討論

真核細胞分裂必須經過兩個關鍵環節：G1-S期和G2-M期。CDKs是細胞周期調節中心，其成員的激活和磷酸化促進細胞從G1-S期和G2-M期的轉變。P16基因通過其表達產物P16蛋白與CDK4結合抑制CDK4的功能。CDK4與CyclinD1結合能使細胞周期進入G1期，而P16蛋白與CDK4結合后，使pRB（視網膜母細胞瘤基因蛋白）磷酸化作用減小，導致轉錄因子E2F釋放減少，細胞從G1期至S期受抑制，從而使細胞生長停滯。在我們檢測的標本中，56例肝癌有13例P16基因缺失，缺失率為23.2%，而31例肝硬化標本僅有1例P16基因缺失，缺失率為3.2%。肝癌中P16的變異應該高于23%，因為P16的其它變異如重排、點突變和P16CPG過度甲基化都沒有進行檢測，并且正常細胞混雜有可能掩蓋P16基因的缺失，導致檢出率降低。25例白血病中有8例P16缺失，缺失率為32%多重PCR檢測ALL病人骨髓標本，用DNA印跡法檢測骨髓的缺失率一致。而20例正常對照者未發現P16基因缺失。

參考文獻

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[2]Serrano M，Hannon GJ，Beach D.A new regulatory motif in cell-cyle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4，Nature，1993，366：704-707.