Annexin A1和VEGF—C在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)及其臨床意義

摘要：目的 研究膜聯(lián)蛋白A1（Annexin A1）與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C （VEGF-C）在人食管鱗狀細(xì)胞癌中蛋白水平的表達(dá)差異，分析二者的相互關(guān)系及其與食管鱗癌臨床病理因素間的關(guān)系，探討二者在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用及其臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組化檢測(cè)68例食管鱗癌及其切緣正常粘膜組織中Annexin A1和VEGF-C的表達(dá)，分析二者的表達(dá)在兩組間是否有差別及其與食管鱗癌患者臨床病理因素間的關(guān)系；并分析食管鱗癌中二者表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 Annexin A1和VEGF-C在食管鱗癌及其切緣正常粘膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異（P<0.05）。Annexin A1的表達(dá)與患者性別、年齡、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)顯著相關(guān)，VEGF-C的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與其他臨床病理因素?zé)o顯著相關(guān)，且二者在食管鱗癌中表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.524，P<0.05）。結(jié)論 Annexin A1基因在食管鱗癌中低表達(dá)，在切緣正常粘膜組織中高表達(dá)，VEGF-C蛋白表達(dá)與Annexin A1蛋白表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)。VEGF-C表達(dá)與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：食管鱗狀細(xì)胞癌；Annexin A1；VEGF-C；免疫組織化學(xué)染色

食管癌是全世界10大常見惡性腫瘤之一，預(yù)后很差，常浸潤(rùn)?quán)徑匾鞴俳Y(jié)構(gòu)導(dǎo)致患者死亡。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程的飛速發(fā)展，基因治療已成為食管癌治療中的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。許多研究者都在探索食管癌中的基因表達(dá)情況及與臨床的關(guān)系，從而達(dá)到治療食管癌，延長(zhǎng)食管癌患者生存期的作用。

膜聯(lián)蛋白家族包括約20余種鈣和磷脂結(jié)合蛋白，膜聯(lián)蛋白A1（annexin A1），是膜聯(lián)蛋白超家族成員之一，能抑制磷脂酶A2，介導(dǎo)凋亡。食管癌患者染色體臂9Q上膜聯(lián)蛋白I基因附近DNA缺失率很高，這表明膜聯(lián)蛋白A1基因功能的喪失在食管癌的發(fā)生中可能起著重要作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）家族編碼5個(gè)多肽，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C（VEGF- C）是VEGF家族成員之一，能特異性的激活表達(dá)在血管及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體VEGFR-2和VEGFR-3（又名Flt-4），通過(guò)酪氨酸激酶信號(hào)系統(tǒng)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，從而刺激血管及淋巴管的生成，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著特別重要的作用。

本研究采用免疫組化法檢測(cè)食管癌中Annexin A1和VEGF-C的表達(dá)，探討二者表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理因素間的關(guān)系及它們的相關(guān)性，為食管癌的診斷和治療提供幫助。

1資料與方法

1.1一般資料 選取中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院2011年3月～2013年3月初次住院的68例食管鱗癌病例及20例切緣正常粘膜組織。受檢者均行手術(shù)治療，術(shù)前均未接受其它治療，術(shù)后標(biāo)本均經(jīng)病檢確診。年齡42～73歲，平均60.4歲，年齡≥55歲者51例，<55歲者17例；男49例，女19例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者40例；組織學(xué)分級(jí)按WHO標(biāo)準(zhǔn)：高中分化癌44例，低分化癌24例；TNM臨床分期：I-II期者43例，III-IV期者25例。

1.2方法 所有標(biāo)本均經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋，病理科切取4 μm厚切片，脫蠟去水，采用免疫組織化學(xué)SABC法[1]，置于3 %H2O2中15min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。高壓抗原修復(fù)充分暴露抗原后自然冷卻，滴加一抗，兔抗人Annexin A1多克隆抗體、鼠抗人VEGF-C多克隆抗體工作濃度均為1：100。4℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗，滴加二抗，37 ℃溫箱內(nèi)孵育30min，PBS沖洗3次；DAB顯色，蒸餾水沖洗、蘇木素襯染，乙醇脫水，二甲苯透明，封片。PBS 代替一抗作陰性對(duì)照， 已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3免疫組化學(xué)結(jié)果判斷 Annexin A1蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色；VEGF-C蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要位于胞質(zhì)，為棕黃色顆粒樣物質(zhì)。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞并計(jì)算其陽(yáng)性率，按陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的百分率進(jìn)行判定。將平均陽(yáng)性率>20 %的歸為陽(yáng)性， ≤20 %的歸為陰性。

2.1Annexin A1和VEGF-C在不同的食管組織中的表達(dá) Annexin A1和VEGF-C在不同的食管組織中的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異（P<0.05），見表1。

2.2 Annexin A1和VEGF-C表達(dá)與食管鱗癌臨床病理因素之間的關(guān)系 Annexin A1在食管鱗癌中的陽(yáng)性表達(dá)率與患者的年齡、性別、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理組織學(xué)分化程度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均無(wú)差異（P>0.05）；VEGF-C在食管鱗癌中的陽(yáng)性表達(dá)率與患者的年齡、性別、病理組織學(xué)分化程度及腫瘤浸潤(rùn)深度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異（P>0.05），但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異（P<0.05），見表2。

3討論

膜聯(lián)蛋白已被報(bào)道在多個(gè)腫瘤中失調(diào)[2，3]，這表明膜聯(lián)蛋白可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。膜聯(lián)蛋白A1的確切功能尚不清楚，它可能參與了細(xì)胞分子的很多步驟，如鈣離子的調(diào)節(jié)，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞粘附，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞骨架的維持和細(xì)胞外基質(zhì)的完整，發(fā)育和分化，炎癥及血液凝固等，它還是細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素抗感染作用的一種效應(yīng)因子，在白細(xì)胞遷移及堆積和吞噬中起著重要作用。

不同的腫瘤組織中，Annexin A1的表達(dá)水平不同。在很多惡性腫瘤中如乳腺癌、原發(fā)性肝癌、胰腺癌、胃癌、轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌和晚期膀胱癌中高表達(dá)，而在另一些惡性腫瘤中如前列腺癌、頭頸部腫瘤及食管癌中低表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)Annexin A1陽(yáng)性表達(dá)率在食管鱗癌組織中為38.2%，顯著低于切緣正常粘膜中的陽(yáng)性表達(dá)率80.0%，食管鱗癌中Annexin A1表達(dá)下調(diào)，這提示Annexin A1表達(dá)減少在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。

膜聯(lián)蛋白A1蛋白的缺失是癌變過(guò)程中的早期事件。膜聯(lián)蛋白A1在各種細(xì)胞系如鱗癌、腺癌等中都發(fā)生了改變，說(shuō)明它可能在人類腫瘤發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。在食管鱗癌患者中膜聯(lián)蛋白A1mRNA水平顯著降低，同一個(gè)患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞中比癌旁正常組織膜聯(lián)蛋白A1表達(dá)下調(diào)，這說(shuō)明在不同位置的癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中有著不同的調(diào)節(jié)機(jī)制。Annexin A1在食管鱗癌中的陽(yáng)性表達(dá)率與年齡、性別、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均無(wú)差異（P>0.05），這說(shuō)明在各種不同臨床病理因素的食管癌患者中Annexin A1都起著很重要的作用。基因下調(diào)的原因包括基因缺失、基因突變、啟動(dòng)子去甲基化等，膜聯(lián)蛋白A1在食管癌中表達(dá)下調(diào)的具體原因尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

在胃癌[4]，乳腺癌[5]等多種腫瘤中，VEGF-C和VEGFR-3過(guò)度表達(dá)，且呈顯著負(fù)相關(guān)。VEGF-C過(guò)度表達(dá)可以誘導(dǎo)淋巴管的生成，并且促使癌細(xì)胞通過(guò)淋巴結(jié)進(jìn)行轉(zhuǎn)移。VEGF-C以旁分泌和自分泌方式分別作用于血管和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，增加癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力和增殖活性，改變淋巴管內(nèi)皮的粘附特性， 增加分泌細(xì)胞因子和趨化因子， 而在腫瘤組織的血管及淋巴管增殖中起著很大的作用[6]。

據(jù)報(bào)道，幾乎所有的食管癌組織均表達(dá)VEGF-C，82%的食管非典型增生組織表達(dá)VEGF-C，而在食管正常粘膜肌層組織中無(wú)1例有VEGF-C的表達(dá)。食管癌中VEGF-C mRNA的表達(dá)明顯高于正常組織[7]。本研究結(jié)果顯示，VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)率在食管鱗癌組織中為75.0%，顯著高于切緣正常粘膜中的陽(yáng)性表達(dá)率45.0%，提示VEGF-C表達(dá)增加在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。

VEGF-C的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯高于對(duì)照組。本研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C在食管鱗癌中的陽(yáng)性表達(dá)率與年齡、性別、分化程度及浸潤(rùn)深度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異（P>0.05），但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異（P<0.05）。VEGF-C表達(dá)是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素，癌組織中VEGF-C表達(dá)陽(yáng)性的患者預(yù)后明顯差于VEGF-C表達(dá)陰性的患者。VEGF-C誘導(dǎo)引起血管通透性增加，這與腫瘤的血行轉(zhuǎn)移有關(guān)。VEGF-C與腫瘤的淋巴管及血管的生成有關(guān)，因而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著特別重要的作用[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C與Annexin A1的表達(dá)呈顯著性負(fù)相關(guān)，說(shuō)明在食管鱗癌中Annexin A1可能通過(guò)調(diào)控VEGF-C的表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但Annexin A1調(diào)控VEGF-C的表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚，部分癌組織中可觀察到膜聯(lián)蛋白A1的自身抗體，這提示相應(yīng)的抗原可應(yīng)用于臨床，但這尚需繼續(xù)進(jìn)行研究。

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