電針刺預(yù)處理抑制腸缺血再灌注性脾細(xì)胞調(diào)亡

摘要：目的 研究電針刺預(yù)處理抑制腸缺血再灌注大鼠脾細(xì)胞凋亡并探討其可能機(jī)制。方法 健康SD大鼠32只，隨機(jī)分為假手術(shù)對照組（S組）、腸缺血再灌注組（IIR組）、電針刺預(yù)處理+腸缺血再灌注組（EA + IIR組）和缺血再灌注6 h后電針刺組（IIR6h+EA組）4組。制取脾標(biāo)本，觀察其組織形態(tài)學(xué)變化；用免疫組化法檢測脾組織bcl-2，bax和c-fos蛋白表達(dá)。結(jié)果 Bax和c-fos蛋白的表達(dá)在EA+IIR組和IIR6h+ EA組明顯少于IIR組，（P<0.01），其中EA+IIR組的表達(dá)又少于IIR6h+ EA組（P<0.01）。Bcl-2蛋白的表達(dá)在EA + IIR組和IIR6h+ EA組明顯高于IIR組（P<0.01），其中EA + IIR組的表達(dá)又高于IIR6h+ EA組（P>0.05）。Bcl-2/bax比值在EA+IIR組和IIR6h+ EA組顯著高于IIR組（P<0.01），其中EA + IIR組的比值又高于IIR6h+ EA組（P<0.01）。結(jié)論 電針刺預(yù)處理可以抑制腸缺血再灌注所致的脾細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)脾臟c-fos、bax蛋白，上調(diào)bcl-2蛋白的表達(dá)以及通過提升bcl-2/bax比值有關(guān)。缺血再灌注前進(jìn)行電針刺預(yù)處理這種抑制作用更明顯。

關(guān)鍵詞：電針刺預(yù)處理；細(xì)胞凋亡；缺血再灌注；脾；腸

腸缺血再灌注損傷（intestine ischemical reperfusion，IIR）是外科常見的病理過程，可引起腸壁組織一系列病理生理改變，并引起遠(yuǎn)隔器官的損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，小腸缺血再灌注后可造成血中氧自由基、脾臟免疫細(xì)胞的凋亡基因表達(dá)改變[1]。對于IIR后腸壁組織細(xì)胞凋亡的抑制有多種方法，包括缺血預(yù)處理（i-schemic preconditioning，IPC）和各種化學(xué)預(yù)處理，但目前對IIR后脾細(xì)胞凋亡干預(yù)措施的研究少有報(bào)道。脾臟在人體中的功能和地位常被忽視，但其在免疫系統(tǒng)中的作用仍值得重視。本研究通過建立大鼠IIR模型，觀察電針刺預(yù)處理對脾細(xì)胞凋亡的影響并探討其可能機(jī)制。

1資料與方法

1.1主要試劑 兔抗大鼠bcl-2、bax和c-fos抗體（購自北京中杉公司生物技術(shù)有限公司），兔抗大鼠二抗（美國LI-COR公司），bcl-2、bax和c-fos免疫組化試劑盒，由北京中山生物工程有限公司提供。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，雄性清潔級，體重（250±20）g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院動(dòng)物試驗(yàn)中心提供。試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，術(shù)前12 h禁食，自由飲水。

1.3模型的建立及分組 健康雄性SD大鼠32只，體重（250±20）g，隨機(jī)分為假手術(shù)對照組（S組）、腸缺血再灌注組（IIR組）、電針刺預(yù)處理+腸缺血再灌注組（EA+IIR組）和缺血再灌注6 h后電針刺組（IIR6h+ EA組）4組，每組8只。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/Kg）麻醉。S組游離腸系膜上動(dòng)脈（ superior mesenteric artery，SMA） 后不夾閉，5 h后處死；IIR組用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉SMA 1 h后再灌注4 h；EA+IIR組在腸缺血再灌注前給予電針刺，1次/d，30 min/次，共7 d，末次電針后24 h行缺血再灌注術(shù)即缺血1h，再灌注4h，余同IIR組；IIR6h+ EA組于缺血再灌注6 h后開始電針刺，操作同EA+IIR組，1次/d，連續(xù)7 d。

1.4穴位的選擇 足三里穴屬足陽明胃經(jīng)，是治療胃腸病的首選穴。電針足三里穴可調(diào)整胃腸功能，按照尋經(jīng)取穴和左右配穴法的原則，本實(shí)驗(yàn)選用足三里來證實(shí)電針刺預(yù)處理抑制腸缺血再灌注性脾細(xì)胞調(diào)亡。足三里穴定位：膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處。電針方法：選用上海醫(yī)用電子儀器廠生產(chǎn)G6805-Ⅱ型電針儀。通電留針30 min，采用連續(xù)波，頻率2 Hz，強(qiáng)度以針柄顫動(dòng)，但能使動(dòng)物不掙扎嘶叫，保持安靜為度。

2結(jié)果

3討論

缺血再灌注損傷的產(chǎn)生因素和發(fā)生機(jī)制尚未清楚。一般認(rèn)為，缺血再灌注能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡或者說細(xì)胞凋亡參與了缺血再灌注損傷發(fā)生、發(fā)展過程，這可能與自由基攻擊、細(xì)胞內(nèi)鈣超載及后者所誘發(fā)的細(xì)胞因子釋放等多種因素有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)小腸缺血再灌注后脾臟免疫細(xì)胞的凋亡基因表達(dá)明顯改變，其中能誘導(dǎo)凋亡的bax、c-fos和P53在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表達(dá)明顯增多，而維持細(xì)胞存活的bcl-2表達(dá)則很少。

資料表明，c-fos是一種早期反應(yīng)基因，在缺血再灌注過程中，可在膜信號和Ca2+的介導(dǎo)下，細(xì)胞核內(nèi)c-fos基因轉(zhuǎn)錄增加，其表達(dá)產(chǎn)物可激活多種其它相關(guān)基因產(chǎn)生多種生理效應(yīng)。Bcl-2即細(xì)胞凋亡抑制基因，是目前發(fā)現(xiàn)的與凋亡關(guān)系密切的原癌基因之一，在正常組織自身穩(wěn)定方面起重要作用。Bax的主要作用是加速細(xì)胞凋亡，并與bcl-2一起調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞內(nèi)bcl-2/bax比例非常重要，bax占優(yōu)勢，細(xì)胞凋亡，而bcl-2占優(yōu)勢時(shí)，細(xì)胞存活。本研究結(jié)果顯示IIR組相對于S組bax表達(dá)明顯高于bcl-2且bcl-2/bax比值明顯降低。

有研究表明電針刺可以通過調(diào)節(jié)多種調(diào)亡相關(guān)基因的表達(dá)，阻止腦缺血后脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)、抑制興奮毒性作用和調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)、防止神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載等方式產(chǎn)生抗調(diào)亡的作用[2]。目前，關(guān)于電針刺對抗心腦肝腎等器官缺血再灌注損傷已有報(bào)道而對其引起遠(yuǎn)隔器官的次級損傷少有報(bào)道。基于此，本實(shí)驗(yàn)選擇電針刺對大鼠腸缺血再灌注引起脾細(xì)胞的影響為研究對象，并探討其可能機(jī)制。劉丹等[3]在研究針刺對局灶性腦缺血再灌注大鼠bcl-2/bax蛋白表達(dá)的影響中發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后6 h，即凋亡早期進(jìn)行電針刺對凋亡的抑制作用優(yōu)于缺血再灌注后12 h及24 h，故本試驗(yàn)選擇缺血再灌注后6 h這個(gè)時(shí)間點(diǎn)與缺血損傷前電針刺預(yù)處理進(jìn)行比較。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果說明，電針刺預(yù)處理可以下調(diào)脾臟c-fos、bax蛋白并上調(diào)bcl-2蛋白的表達(dá)以及通過提升bcl-2/bax比值來抑制脾細(xì)胞的凋亡，并且，在缺血損傷前進(jìn)行電針刺預(yù)處理的效果明顯優(yōu)于缺血再灌注后再進(jìn)行電針刺治療，這可能與電針刺可以下調(diào)脾臟c-fos、bax蛋白的表達(dá)而相對升高bcl-2/bax比值有關(guān)。Bcl-2陽性率在EA + IIR組和IIR6h+ EA組之間比較無差異，還不能證明IIR6h后電針刺可通過升高bcl-2蛋白的表達(dá)來抑制脾細(xì)胞凋亡。

綜上所述，可以得出這樣的結(jié)論：電針刺的抗凋亡作用不僅存在于原發(fā)器官缺血再灌注損傷也存在于其引起遠(yuǎn)隔器官的次級損傷。尚需對更多組織細(xì)胞及凋亡蛋白上游基因的研究來支持這一結(jié)論。

參考文獻(xiàn)：

[1]趙佐慶，張志培，陳洪茂，等.犬小腸缺血再灌注后氧自由基改變及脾臟免疫細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)變[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2005，25（3）：244-247.

[2]朱永磊，宋小鴿.針刺對細(xì)胞凋亡的影響[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2007，19（2）：102-104.

[3]劉丹，韓威，張迪，等.不同時(shí)間針刺對局灶性腦缺血再灌注大鼠BCL-2/Bax蛋白表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25（3）：622-623.

編輯/肖慧