先天性心臟病永生性基因庫的建立和相關(guān)基因研究

摘要：目的 整合miRNA和基因芯片數(shù)據(jù)，篩選與小兒法洛四聯(lián)癥相關(guān)的miRNA和調(diào)控的基因，并對靶標基因進行功能研究。方法 從基因表達數(shù)據(jù)庫GEO數(shù)據(jù)庫中下載編號GSE35490（miRNA）和GSE35776（mRNA），兩種數(shù)據(jù)均包含8個正常和16個患法洛四聯(lián)癥的嬰兒細胞組織樣本，篩選正常樣本和疾病樣本間特異性表達的miRNA和基因（P<0.05且FDR<0.05及差異值>2或< -2）；從miRNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫Targetscan中下載人類所有miRNA以及它們的預測靶基因信息，從中篩選出本分析中找到的特異性表達的miRNA和它們的靶基因（prediction>0.9的記錄），將數(shù)據(jù)庫中找到的靶基因與分析找到的差異表達基因?qū)?yīng)，挑選出差異表達miRNA調(diào)控的差異表達的基因，再利用string構(gòu)建miRNA參與的基因共表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（共表達系數(shù)>0.5），并把網(wǎng)絡(luò)中的基因上傳至DAVID中做功能聚類分析（p value<0.05）。結(jié)果 通過比較正常和病變樣本，我們共得到了差異表達的miRNA 32個，差異表達的基因875個，根據(jù)Targetscan中miRNA以及靶基因信息，找到了差異表達的hsa-miR-124直接調(diào)控分析找到的34個差異表達基因，hsa-miR-138直接調(diào)控2個差異表達基因，構(gòu)建了包含231對共表達基因?qū)Φ膍iRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中基因功能顯著地富集14個功能簇，最顯著富集在蛋白質(zhì)定位功能上。結(jié)論 找到差異表達的miRNA hsa-miR-124和hsa-miR-138直接和間接調(diào)控的差異表達基因，得到兩個miRNA參與的基因共表達網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中的基因最顯著富集在蛋白質(zhì)定位功能上。

關(guān)鍵詞：法洛四聯(lián)癥；差異表達；共表達網(wǎng)絡(luò)；功能富集分析

法洛四聯(lián)癥（tetralogy of fallot，TOF）是最常見的紫紺屬先天性心臟病。在先天性心臟病臨床統(tǒng)計中，TOF占6.0% ，居先天性心臟病的第5位、紫紺屬畸形的第1位[1]。在TOF的基本病理改變中，室間隔缺損及肺動脈狹窄被認為是最主要的病變，決定了患兒的血流動力學改變，除了室間隔缺損、主動脈騎跨、肺動脈狹窄及右心室肥厚這四項基本病變外，TOF常伴有許多伴隨畸形，嚴重威脅著嬰兒生命健康[2]。為搶救和永久保存江西省豐富而珍貴的先天性心臟病遺傳資源， 在此基礎(chǔ)上利用近年來多基因遺傳疾病的研究進展和DNA芯片技術(shù)，以先天性心臟病椎動脈干畸形中的法樂氏四聯(lián)癥為突破點，研究其形成機制及易感相關(guān)基因，為揭示心臟的發(fā)生的分子生物學機制，先天性心臟病的形成機制打下堅實的基礎(chǔ)，并為進一步的先天性心臟病基因診斷和治療打下基礎(chǔ)。利用基因芯片技術(shù)，篩選克隆法洛氏四聯(lián)癥的易感和/或疾病相關(guān)基因。本文基于來自相同組織樣本的兩種不同芯片數(shù)據(jù)：miRNA和基因芯片，篩選特異性表達的miRNA以及調(diào)控的差異表達的基因，構(gòu)建共表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為該疾病的及早診斷和治療提供了基因水平的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 Affymetrix miRNA芯片數(shù)據(jù) 從基因表達數(shù)據(jù)庫GEO數(shù)據(jù)庫中下載編號GSE35490（miRNA）和GSE35776（mRNA）[3]，兩種數(shù)據(jù)均包含8個正常和16個患法洛四聯(lián)癥的嬰兒細胞組織樣本。這兩組數(shù)據(jù)均是法洛氏四聯(lián)體癥相關(guān)數(shù)據(jù)，來自相同時實驗室的相同的個體樣本，測的都是嬰兒右心室心肌組織的表達譜。平臺信息：GPL8786[miRNA-1_0] Affymetrix miRNA Array和GPL5175[HuEx-1_0-st] Affymetrix Human Exon 1.0 ST Array。

1.2數(shù)據(jù)預處理及差異基因分析 首先利用R語言包中的Affy包將下載到的原始CEL格式的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成可識別的表達譜格式，包括對數(shù)據(jù)中缺失的部分進行填補[4]；接著對補完缺失的數(shù)據(jù)進行標準化[5]。再利用R語言中的limma[6]包對正常和病變組做差異表達分析，并用BH方法進行多重檢驗矯正[7]，篩選特異性表達的miRNA和基因，選取的閾值是：p-value<0.05且FDR<0.05，且|logFC|>1。

1.3下載數(shù)據(jù)庫中已知的miRNA與靶基因 從miRNA數(shù)據(jù)庫TargetScan[8]中下載其中收錄的所有人類miRNA以及每個miRNA所對應(yīng)的預測靶基因，基于靶基因跨物種保守和miRNA-靶基因二聚體熱力學特征[9]的方法預測靶基因，篩選得分高于0.9的作為候選的的調(diào)控對。

1.4篩選差異表達miRNA直接調(diào)控的差異基因 根據(jù)置信度高的調(diào)控對篩選出本出現(xiàn)在差異表達的miRNA集合中的個體。利用差異表達基因與篩選出的差異miRNA已知的靶基因?qū)?yīng)，得到差異表達的miRNA調(diào)控下差異表達的基因。

1.5構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò) 將篩選得到的特征表達的miRNA調(diào)控的差異表達基因上傳至string[10]中，該軟件根據(jù)輸入基因序列自身的特性和結(jié)構(gòu)特點，預測各個基因之間發(fā)生共表達的可能性，即計算各基因之間的表達系數(shù)，保留表達系數(shù)高于0.5的作用對，構(gòu)建特異表達的miRNA參與的基因共表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.6共表達網(wǎng)絡(luò)中基因功能的研究 利用DAVID[11]在線軟件，基于超幾何分布算法的富集分析，篩選p value <0.05且count>2，得到基因所在的功能簇。

2 結(jié)果

2.1差異表達的miRNA和基因的篩選 利用R語言limma包對標準化后的兩種表達譜數(shù)據(jù)分別做差異表達分析，共篩選得到了差異表達的miRNA 32個，差異表達的基因875個（滿足閾值P value <0.05且FDR<0.05，|logFC|>1），見表1。

2.2下載數(shù)據(jù)庫中已知的miRNA與靶基因 下載miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫TargetScan中收錄的所有人類miRNA及預測靶基因，共2393544條記錄。只保留靶基因的預測得分高于0.9的miRNA家族和它們的靶基因作為候選的調(diào)控對，包含24個miRNA家族和203個靶基因。

2.3篩選差異表達miRNA調(diào)控的差異基因 芯片分析得到的差異miRNA和差異表達基因，結(jié)合從TargetScan收集的調(diào)控對，得到了hsa-miR-124調(diào)控的34個差異表達基因，hsa-miR-138調(diào)控的LMAN1和LYPLA1這2個差異表達基因。

2.4構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò) 所有篩選得到的差異表達的基因中，除了hsa-miR-124調(diào)控的34個和hsa-miR-138調(diào)控的2個差異表達基因外，可能會存在這兩個miRNA間接調(diào)控的差異表達基因。因此，利用string計算875個差異基因之間的共同表達系數(shù)，篩選共表達系數(shù)>0.5的作用對，最終得到231對共表達作用對。結(jié)合miRNA調(diào)控關(guān)系構(gòu)建miRNA調(diào)控靶基因的網(wǎng)絡(luò)，如圖1。由圖可見，除了已知的受到兩個miRNA調(diào)控的差異表達基因外，仍有13個基因受到間接調(diào)控。

2.5共表達網(wǎng)絡(luò)中基因功能的研究：將網(wǎng)絡(luò)中的所有基因利用DAVID進行富集分析，篩選p value<0.05且count>2，得到基因富集的功能簇14個，其中最為顯著的功能為蛋白質(zhì)定位，見表1。

3 討論

法洛四聯(lián)癥（TOF）是一種嚴重的先天性心臟病，發(fā)病率位于發(fā)紺型先天性心臟病之首。手術(shù)難度大，死亡率高，并發(fā)癥發(fā)生率高[12]。有文獻報道，嬰幼兒TOF的手術(shù)死亡率也在0%～5%之間[13]。TOF疾病常見的其它畸形有：多發(fā)性室間隔缺損、周圍肺動脈狹窄、冠狀動脈畸形、右位主動脈弓、動脈導管未閉、房間隔缺損、左上腔靜脈缺如等[2]。

近年來，隨著對TOF病理改變的理解越來越深刻，以及要幼兒TOF手術(shù)的開展，TOF根治術(shù)的成功率有明顯的提高，但受多種因素的影響，手術(shù)仍有一定的風險，如：除肺動脈直徑及周圍肺動脈有無狹窄外，冠狀動脈的解剖異常及存在多發(fā)性室間隔缺損是另外兩個至關(guān)重要的因素[14]。因此，法洛四聯(lián)癥對于幼兒的危害是非常大的，縱使手術(shù)可以治療，但手術(shù)由于受到多種因素的影響，也是相對有風險的。此外，在手術(shù)后，也會存在很多的并發(fā)癥，如：灌注肺、呼吸衰竭等[15]。

TOF疾病不管是疾病本身，還是手術(shù)治療過程中，又或者手術(shù)后，對幼兒的生命健康都非常具有危害性。本分析基于來自TOF患病兒的miRNA和同組 mRNA表達譜數(shù)據(jù)，通過生物信息學分析手段，篩選得到了顯著下調(diào)的兩個miRNA（hsa-miR-124和hsa-miR-138）及它們已知的靶基因（hsa-miR-124直接調(diào)控的34個和hsa-miR-138直接調(diào)控的2個靶基因），且這些已知靶基因同時也是組織中差異表達的基因，并由已知的靶基因得到與之共同表達的差異基因。篩選得到的這些基因如果通過實驗驗證，將有希望成為早期診斷TOF疾病的一種標志，針對這些基因靶向性地設(shè)計藥物治療也將會成為現(xiàn)實。只要能夠?qū)⒃摷膊〖霸绲匕l(fā)現(xiàn)和治療，就會時患病的幼兒免受手術(shù)帶來的風險以及手術(shù)后有可能會帶來的并發(fā)癥痛苦。

參考文獻：

[1]劉玉清，主編.心血管病影像診斷學[M].合肥：安徽科學技術(shù)出版社，2000：482.

[2]楊思源.小兒心臟病學[M].第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：104-105.

[3]O'Brien JE Jr， Kibiryeva N，Zhou XG，Marshall JA，et al. Noncoding RNA expression in myocardium from infants with tetralogy of Fallot[J].Circ Cardiovasc Genet ，2012，5（3）：279-286.

[4]Missing value estimation methods for DNA microarrays，Troyanskaya，O.Cantor，M.Sherlock，G.Brown，P.Hastie，T.Tibshirani，R.Botstein，D.and Altman，R.B.[J].Bioinformatics，2001，17（6）：520-525.

[5]Evaluating different methods of microarray data normalization，André Fujita，Jo？o Ricardo Sato，Leonardo de Oliveira Rodrigues，Carlos Eduardo Ferreira and Mari Cleide Sogayar.

[6]Smyth，G.K.Limma：linear models for microarray data.In： Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor，R.Gentleman，V.Carey，S.Dudoit，R.Irizarry，W.Huber（eds）[J].Springer，New York，2005：397-420.

[7]Benjamini，Y.and Hochberg，Y.（1995）Controlling the 1 discovery rate：a practical and powerful approach to multiple testing[J].Journal of the Royal Statistical Society Series B，57：289-300.

[8]Prediction of Mammalian MicroRNA Targets.Benjamin P Lewis1，3，I-hung Shih2，3，Matthew W Jones-Rhoades1，2， David P Bartel1，2，Christopher B Burge1[J].Cell， 2003，115 （7）.

[9]Conserved Seed Pairing，Often Flanked by Adenosines，Indicates that Thousands of Human Genes are MicroRNA Targets Benjamin P Lewis，Christopher B Burge，David P Bartel[J].Cell，2005，120：15-20.

[10]The STRING database in 2011：functional interaction networks of proteins，globally integrated and scored.

[11]Huang DW，Sherman BT，Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources[J].Nature Protoc，2009，4（1）：44-57.

[12]張鏡芳，莊建，吳若彬，等.136例成人法洛四聯(lián)癥的外科治療[J].中華外科雜志，1998，36：747-748.

[13]Pozzi M，Trivedi DB，Kitchiner D，et a1.Tetralogy of Fallot：what operation，at which age[J].Eur J Cardiothorac Surg，2000，17：631-636.

[14]高文根，汪曾煒，張仁福，等.要兒法樂四聯(lián)癥外科治療的危險因素分析[J].中華小兒外科雜志，2004，25（5）：417.

編輯/哈濤