熒光定量PCR技術在肺炎鏈球菌檢測中的應用

摘要：目的 通過熒光定量PCR技術對痰中肺炎鏈球菌（SP）的檢測，明確其較傳統檢測方法的優越性。方法 收集2013年1月～2014年1月入住我院呼吸科的123例AECOPD患者，對合格痰標本（108例）進行培養，觀察培養結果；通過熒光RT-PCR技術檢測痰標本中的SP，并粗略估算SP的感染率。結果 合格痰標本108份，SP培養陽性率6.5%；而應用熒光PCR定量檢測，陽性率為58.3%，粗略估計AECOPD中SP的感染情況，約為17.6%。結論 熒光定量PCR對細菌的檢測明顯優于傳統培養方法。

關鍵詞：肺炎鏈球菌；COPD急性加重期；熒光定量PCR；痰細菌培養

1 資料與方法

1.1一般資料 收集我院123例臨床確診的AECOPD患者，入院時間為2013年1月～2014年1月，其中男性78例，女性45例，年齡46～87歲，既往有吸煙史者54人。全部病例符合中華醫學會呼吸病學會慢性阻塞性肺疾病診治指南（2007年及2013年修訂版）的診斷標準[1，2]，患者主要表現有氣促加重，常伴有喘息、胸悶、咳嗽加劇、痰量增加、痰液顏色和（或）黏度改變、發熱及全身癥狀等，入院患者均具有CT，排除其他病變如肺癌、單純肺炎、肺結核、肺間質病等，10例患者合并支氣管擴張，入院前應用抗生素者22例。為減少抽樣誤差并排除季節及環境因素的影響，研究時間>1年。

1.2 實驗儀器與試劑 基因擴增儀（型號為Roche Light Cycler480），全自動細菌鑒定藥敏分析儀（美國碧迪）。引物、探針、標準品（大連寶生物工程有限公司合成）；肺炎鏈球菌標準菌株，型號為BZW23112； 柱式小量細菌基因組 DNA 抽提試劑盒[3] （W6511）（上海華舜生物技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 痰標本的收集 留取患者入院后次日清晨的合格痰標本。合格標本的判定標準（顯微鏡下）：鱗狀上皮細胞<10個/低倍視野 、中性粒細胞>25個/低倍視野，或兩者比例<1：2.5。對上述標本進行革蘭氏染色，對細菌數量、形狀進行記錄。留取部分標本進行培養，余收集在標準為1.5ml的EP管中，于-80℃冰箱中凍存。

1.3.2 痰培養過程 合格痰液標本2h內進行培養操作。清洗后標本轉移至無菌管中，加入消化液至標本體積的2倍，充分顛倒混勻，靜置30min，然后按衛生部微生物操作規程，三區劃線將標本分別接種于血、伊紅美藍及巧克力瓊脂平板上，置于35℃、5%二氧化碳孵箱中過夜培養，18～24h觀察培養情況，對優勢生長的細菌進行分離并進行藥敏實驗，于48h回報培養及藥敏結果。

1.3.3 熒光定量PCR過程

1.3.3.1 標準品的設計 將SP純菌液濃度稀釋為107、106、105、104、103 5個梯度，作為對比（單位為cfu/ml）。用標準菌株BZW23112提取出的DNA制作標準品：構建線性化質粒，

1.3.3.2 引物及熒光探針的設計 選取SP的特異性擴增引物自溶素基因（lytA），探針標記FMA熒光基團。應用Primer Express 軟件分析標準菌株的基因序列，在保守區域篩選引物，并在該引物的擴增區域內設計一條特異性熒光探針，按照反應體系的條件分別加入引物、探針、標準品及待測DNA，采用兩步法PCR擴增標準程序，預變性：95 oC 30秒 1 Cycle，兩步法PCR：95 oC 5秒 60 oC 20秒40 Cycle。

1.3.3.3 標準品擴增曲線及標準曲線 見圖1，圖2。

1.3.3.4 檢測標準 空白對照管及未測出SP的管內CT值為空；標準曲線擬合度絕對值應大于或等于0.98；樣本檢測無數值時為陰性。

1.4 統計學分析 實驗結果采用SPSS11.5統計學軟件進行分析，依實驗數據特點選擇適當的統計方法，采用平均數、Fisher's檢驗等統計方法進行數據處理，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 痰培養檢測結果 123例AECOPD患者中，留取合格痰標本數為108份，其痰培養結果為：銅綠假單胞菌，占8.3%，肺炎鏈球菌為7例，占6.5%，其余分別為白色念珠菌，占4.6%，肺炎克雷伯桿菌，占2.8%，陰溝腸桿菌，占1.9%，大腸埃希菌，占1.9%，奇異變形菌及熒光假單胞菌，均約占0.9%。

2.3 SP的感染情況 依半定量培養結果，在SP的菌落數≥105cfu/ml時，考慮其為感染性致病菌，而小于105cfu/ml時則認為SP為非主要致病菌或為污染菌。至今對拷貝數確定是否為感染，尚無明確報道，但根據標準品與純菌液對比相關實驗可以近似推斷，PCR結果在大于等于104時，考慮為致病菌感染；感染SP的例數為19例，所占比例為17.6%。

2.4 相關因素的影響 入院前應用抗生素者為22例，去掉標本不合格的患者數2例，對感染SP與未感染SP患者應用抗生素情況進行統計學分析，統計分析結果示：P值>0.05，結果顯示兩者無顯著性差異。既往有吸煙史患者54例，去掉標本不合格患者數5例，對SP感染患者及非SP感染患者與吸煙因素進行相關性分析，結果顯示P>0.05，亦無顯著性差異。

3討論

做為成人下呼吸道最常見、最主要的病原菌，肺炎鏈球菌的致病性之強、危害性之大已成為了全球亟待關注的問題之一；因此，及早發現、及時治療尤為重要；對于SP的檢測方法種類較多，如痰液的細菌培養、Optochin敏感試驗、菊糖發酵試驗、膽汁溶菌試驗、免疫層析法等，但臨床仍以痰培養做為主要檢測方式；該方式對于培養的條件、檢測時間的掌握均很苛刻；且培養耗時長，結果滯后，易導致病情的延誤；對此，研究者們努力致力于新式檢測方法的開發，熒光定量PCR技術便是其中一種，該方法不僅靈敏度高、特異性強，同時耗時更短，且克服了傳統PCR易污染、不能定量等缺陷，為疾病的基因學診斷開拓了更為廣闊的前景。

近年來，應用RT-PCR檢測病原菌的相關報道已逐漸增多，如結核分支桿菌的檢測已開始應用于臨床；Davinder等曾初步對COPD患者的痰液進行熒光定量PCR檢測，驗證了RT-PCR在臨床應用上的重要作用；為進一步探索RT-PCR在單菌種中的應用價值，本實驗在痰細菌培養方法檢測AECOPD中SP的基礎上，通過熒光定量PCR技術，比較兩種技術檢測SP所得結果陽性率的差別，并進一步推斷AECOPD中SP的感染情況，探索RT-PCR技術更為廣泛的臨床價值。

細菌感染是引起AECOPD最常見的原因，研究者多數仍以痰細菌培養的方式對致病菌進行確定，但所得結論差別較大。西方國家學者經研究，普遍觀點認為AECOPD的致病菌前三位為流感嗜血桿菌，肺炎鏈球菌，卡他莫拉菌；而我國的研究結果卻無明顯共性；此次，本實驗共收集123例AECOPD患者，對其中合格痰標本108例進行培養，依據培養的規范化流程進行痰液細菌培養，結果發現SP培養的陽性率僅為6.5%。

RT-PCR做為一項較為熱門的分子學研究方法，為實驗室與臨床構建了重要的橋梁；Samuel Yang等首次應用RT-PCR技術對成年人SP肺炎的痰標本進行了前瞻性研究，證明了該方法以痰液為檢測樣本，比普通痰培養方法更敏感性，也更節省時間；RT-PCR對咽拭子的檢測也有報道，Herein等對比了RT-PCR及半定量培養兩種方法，檢測鼻咽分泌物中SP的含量，得出RT-PCR的敏感性達到了100%，特異性96%。本實驗主要對AECOPD患者中SP的感染進行研究。在實驗設計過程中，選取自溶酶（lytA）做為特異性基因，制備引物、探針及標準品；實驗室應用RT-PCR對細菌進行研究，多采用的單位為拷貝數，即在細菌細胞中，某種特定質粒的數目；以拷貝數計量，可以精確到所檢測細菌的個數；而臨床上應用RT-PCR，多采用菌落數，即CFU（Colony-Forming Units），菌落中所繁殖的細菌個數不固定，拷貝數與菌落數的換算可根據標準品與純菌對比進行轉換獲得；檢測標本數為108例，其中PCR陽性結果為63例，檢測范圍在1.598×101 -3.126×106，陽性率占58.3%，明顯高于痰細菌培養（6.5%），顯示了RT-PCR在單菌種特別是難培養菌種如SP檢測中的優勢。根據標準品與純菌液對比相關實驗我們又可以近似推斷，感染SP的例數為19例，所占比例為17.6%。

患者多在入院前自行口服或靜點抗生素，抗生素濫用現象嚴重，極易造成耐藥菌的生長，給臨床治療及藥物選擇帶來困難。對此，我們統計了所收集患者入院前用藥情況，應用相關抗生素者為22例，去掉標本不合格的患者數2例，根據感染與未感染SP分組，統計分析結果提示：P值>0.05，結果顯示兩者無顯著性差異。由此可以推測，相關抗生素的應用在感染SP的AECOPD患者中作用不明確。推測其結果，不除外機體的自身免疫參與病原體清除，也可能是患者未規范應用藥物或藥物未覆蓋SP，導致病情延誤甚至加重。

對臨床相關影響因素的研究，選擇有無吸煙史作為一項研究因素，結果顯示P>0.05，無顯著性差異。由此判斷，吸煙做為COPD的一項誘因，與SP在AECOPD中的感染無直接關系。

應用本方法，極少量的SP也能夠被檢出，故分析其是否為致病菌尤為重要：做為口咽部的正常菌群，檢測出SP，并不能直接判定感染，需要數量上的數據支持；而且，SP也是部分穩定期COPD下呼吸道存在的定植菌；因此，即使檢測出患者痰中的SP，也可能說明此為引起AECOPD的原因。我們曾嘗試留取穩定期COPD患者的痰液標本，但穩定期患者多數無痰或痰量很少，留取標本多不合格，無法進行培養或DNA的提取，故本實驗未對穩定期患者進行研究。綜上，SP檢測的方法學各具特點，以此為基礎，我們仍應當結合患者的癥狀及其他檢查來明確病因，以避免因錯誤判斷而錯過最好的治療時機。

參考文獻：

[1]中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組.慢性阻塞性肺疾病診治指南（2007年修訂版）.中華結核和呼吸雜志，2007，30（1）：8-17.

[2]中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組.慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013年修訂版）.中華結核和呼吸雜志，2013，36（4）：255-264.

[3]WHO： Pneumococcal conjugate vaccine for childhood immunization-WHO position paper[J]. Wkly Epidemiol Rec，2007， 82（12）：93-104.編輯/許言