HPLC法測定六味地黃膠囊中馬錢苷含量

摘要：目的 建立六味地黃膠囊中馬錢苷含量測定方法。方法 采用Phenomenex色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸（8：92）；流速1.0ml·min-1，柱溫30℃，檢測波長為236nm。結(jié)果 馬錢苷在11.25μg/ml～180.0μg/ml范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系（r=0.9993），定量限為7.88ng·ml-1，回收率為97.1%，RSD為1.2%（n=9）。結(jié)論 本方法簡便、準(zhǔn)確。方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可作為六味地黃膠囊質(zhì)量分析控制方法。

關(guān)鍵詞：六味地黃膠囊；馬錢苷；高效液相色譜

六味地黃膠囊由熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓澤瀉六味中藥經(jīng)提取精制而成，為硬膠囊劑，內(nèi)容物為淺棕色至棕色的粉末和顆粒；味苦，微酸。本方源于脈安沖劑，具有滋陰補腎之功，臨床用于腎陰虧損、頭暈耳鳴、骨蒸潮熱、盜汗遺精[1]。酒萸肉為山茱萸科植物山茱萸Cornus of ficinalisSieb.etZucc.的干燥成熟果肉。山茱萸中主要成分有有機酸及其酯類、五環(huán)三萜及其酯類、環(huán)烯醚萜苷類、鞣質(zhì)類、多糖、維生素、氨基酸和礦物質(zhì)等。《中國藥典》[1]六味地黃膠囊含量測定項采用薄層掃描法測定熊果酸存在于許多藥材，如山楂，馬鞭草，車前草等非山茱萸的特有成分。并與齊墩果酸在天然植物中是共生共存的[2]，他們都屬三萜酸，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上是差向異構(gòu)體，極性幾乎無差別，在薄層板上應(yīng)用無法分離開，所以測定的量是熊果酸與齊墩果酸含量的總和。為加強本品內(nèi)在質(zhì)量控制，同時對方法中供試品制備的提取溶劑、提取方法、提取時間、提取溶劑用量均進行了考察，制定了本品中的馬錢苷含量測定方法。

1儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀，G1315D DAD二極管陣列檢測器，所用軟件為ChemStation色譜工作站。Milli-Q Advantage A10超純水機，Satorius ME5電子分析天平，電熱恒溫水浴鍋。

1.2試藥 六味地黃膠囊（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格每粒裝0.3g，批號120701、120702、130101、130102）；馬錢苷對照品，購自中國食品藥品檢定研究院（批號為120752-201115）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2色譜條件

色譜柱：Phenomenex色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸（8：92）；流速：1.0ml·min-1；檢測波長：236nm；柱溫：30℃；進樣量：10μl，見圖1。

3制備溶液

3.1對照品 取適量馬錢苷，精密稱定，混入50%甲醇制成每1ml含馬錢苷60μg的溶液，即得。

3.2供試品 取裝量差異項下的本品，混勻，取約0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密倒入25ml50%甲醇，密塞，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足缺失量，搖勻，濾過。取濾液10ml，加氧化鋁柱（100～200目，4g，內(nèi)徑為1cm）上，用50ml 40%甲醇洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘渣用50%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中并稀釋到刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

4線性關(guān)系考察

取馬錢苷適量，制得一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液（濃度為180μg/ml），將儲備液分別稀釋成濃度為11.25μg/ml、22.50μg/ml、45.00μg/ml、90.00μg/ml、180.0μg/ml的溶液，進樣5μl，以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得馬錢苷回歸方程為Y=35.4757X+0.7569，r=0.9998，說明馬錢苷在11.25μg/ml～180.0μg/ml，呈良好線性關(guān)系。

按信噪比（S/N）為10：1計算，定量限為7.78ng/ml。

5精密度試驗

吸取馬錢苷溶液各5μl，重復(fù)6次，用峰面積計算RSD值為0.79%，說明該方法精密度良好。

6重復(fù)性試驗

取同一供試品（批號為120701），按3.2制備供試品溶液，平行制備6份，測定，結(jié)果馬錢苷的平均含量為3.1mg/g，RSD=1.0%，說明該方法重復(fù)性良好。

7中間精密度試驗

取同一供試品（批號為120701），按3.2制備供試品溶液，由兩位分析人員于不同時間分別制備6份供試品并分別使用兩臺儀器測定，計算RSD值為1.3%，說明其方法中間精密度良好。

8穩(wěn)定性試驗

取同一供試品（批號為120701），按3.2步驟，分別在第0、1、2、4、6、8、12、16h進行測定，計算峰面積RSD值馬錢苷為0.5%，說明供試品溶液在16h內(nèi)穩(wěn)定良好。

9回收率試驗

取已知含量的樣品（批號120701，馬錢苷的含量為3.1mg/g）九份，每份0.5g，分別按80%、100%和120%加入對照品，按3.2制備供試品溶液，分別精密吸取10？滋L，注入液相色譜儀，測定，計算加樣回收率，見表1。

試驗結(jié)果表明，馬錢苷平均回收率為96.7%，RSD為0.8%。

10樣品測定

取4批樣品，按3.2步驟，分別吸取供試品和對照品溶液各5μl，注入高效液相色譜儀，測定，計算，見表2。

11討論

11.1色譜條件耐用性考察：本文對不同品牌色譜柱、不同柱溫和不同流動相比例進行了考察，結(jié)果表明本文采用的色譜條件耐用性良好。

11.2測定波長的選擇及色譜峰純度驗證：馬錢苷是酒萸肉的主要活性成分之一，其含量能反應(yīng)六味地黃膠囊的質(zhì)量；根據(jù)馬錢苷的全波長紫外吸收光譜及文獻，選擇236nm做為測定波長，經(jīng)試驗在此波長下，供試品色譜中馬錢苷峰與其它雜質(zhì)峰達到很好的分離，陰性樣品無干擾。使用二極管陣列檢測器，對對照品溶液與供試品溶液色譜中馬錢苷的吸收峰，分別讀取了190～370nm的紫外吸收光譜。經(jīng)對二者的紫外吸收光譜進行比較，發(fā)現(xiàn)馬錢苷紫外吸收光譜相似度達到97%。

11.3提取方法的考察：采用正交試驗法優(yōu)化提取方法，考察提取溶劑、提取時間、提取方法及溶劑用量，4個因素對提取結(jié)果的影響。最終確定提取方案為：25ml的50%甲醇，加熱回流1h[3]。

11.4六味地黃膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層色譜法測定熊果酸含量，重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性較差，本實驗建立的方法操作簡單、快速，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可作為六味地黃膠囊質(zhì)量控制的依據(jù)。

參考文獻：

[1]張艷敏，趙儀學(xué)，景連葉.HPLC法測定六味地黃膠囊中丹皮酚的含量[J].河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，1（24）：52～53.

[2]袁厚蘭，王琳.HPLC法測定不同來源山茱萸中馬錢苷的含量[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013，9（4）：23～25.

[3]林燕飛，孫靜蕓，胡巧平.山茱萸中馬錢苷含量測定的樣品處理方法改進[J].中國藥業(yè)，2005（10）.

編輯/許言