大腸桿菌素對抗尿路感染的研究現狀與展望

摘要：臨床上多重耐藥菌株普遍出現的重要原因之一是廣譜抗生素的普遍使用；大腸桿菌是泌尿外科臨床中最常見也是最難治療的多重耐藥菌株之一，如何預防及治療大腸桿菌的感染、有效避免多重耐藥菌株的出現是迫在眉睫的臨床問題。大腸桿菌素由大腸桿菌產生，其抗菌譜窄，不易產生耐藥性，被視為有效的預防策略之一，很有可能成為新一代的抗菌藥物。本文綜述了重要的大腸桿菌素作為一種替代手段來預防、治療尿路各種大腸桿菌相關的感染，分析其抗尿路感染的前景及臨床應用所面臨的問題。

關鍵詞：大腸桿菌；細菌素；大腸桿菌素；尿路感染；耐藥性

細菌素是由細菌產生的一種蛋白類抗菌物質，為一類抗菌肽，通常只作用于與產生菌同種的其他菌株或親緣關系很近的菌株[1，2]。細菌通常會產生毒素來殺滅競爭細菌。大腸桿菌素就是由大腸桿菌產生并對近緣大腸桿菌產生毒性的一種細菌素，通過結構蛋白殺死細菌[3]。現就大腸桿菌素作用機理、臨床應用價值與前景、面臨的問題等進行文獻綜述。

1大腸桿菌素的生物學特點

大腸桿菌素是由大腸桿菌所分泌的毒性蛋白質，對大腸桿菌及其相近菌種造成毒殺的效果[4]。到目前為止已經描述的大腸桿菌素超過34種，報道較多的是：A、B、D、E1-E9、Ia、Ib、JS、K、M、N、U、5、10 等。一般情況下，他們相互作用到敏感細菌包括三個步驟[5]：①大腸桿菌素分子結合到細菌外膜的特定受體上；②通過細胞膜易位；③特定分子對靶細胞的致死作用。大腸桿菌素蛋白質具有3種結構域：運輸結構域（主要負責把這種蛋白質轉運進靶細胞）、受體結合結構域（主要負責與目標細胞特異受體相結合）、殺傷結構域（主要通過小孔形成和核酸酶產生作用）。當能產生細菌素的細胞開始合成殺傷結構域時，殺傷結構域首先和一種免疫蛋白相結合，這種免疫蛋白在移除之前起作安全帽的作用。殺傷的特異性是由受體結合結構域來決定[6]。不同的大腸桿菌素其作用方式和抗菌效果也不盡相同，而不同的大腸桿菌素組合的抗菌效果也不相同。

2重要大腸桿菌素的抗尿路感染作用

由于細菌素是由細菌產生的高度特異的天然抗生素，只對產生細菌素菌株的近緣細菌有毒性作用[7]。人們開始著手研究大腸桿菌細菌素的抗大腸桿菌感染的作用及機理。重要的有以下幾種。

2.1大腸桿菌素E2預防導尿管所致尿路感染的作用 需要留置導尿管的患者會出現泌尿道病原體慢性感染和尿路感染的復發[8]，而長期留置導尿管會使尿道病原體形成生物膜，這種病原體在尿液中持續種植，細菌定植在生物膜上，對標準抗菌劑有很強的抵抗作用[9]。因此，在長期留置導尿管的患者，抗生素不能有效的防止泌尿道感染，更加不利的是頻繁運用抗生素會導致病原體耐藥性的出現，以及二重感染[10]。這促使人們尋找新的預防及治療方法。

有研究在瓊脂板上種植K-12，col+，37℃條件下培養過夜，然后暴露在氯仿中殺死該菌，在瓊脂平板上覆蓋108cfu/ml測試菌株（colS或者colR），培養過夜。結果表明：均勻的涂有ColS的瓊脂平板上可見清晰的抑菌帶（直徑>10mm）出現在K-12，col+接種周圍。ColS的抑菌帶沒有出現在K-12，col-周圍，均勻涂有ColR的瓊脂平板上亦沒有出現抑菌帶，證明ColS被質粒陽性K-12所產生的大腸桿菌素E2殺死或者抑制。這說明：大腸桿菌K-12涂在導尿管上其產生的大腸桿菌素E2能完全預防對大腸桿菌素敏感的大腸桿菌在其上面的增殖[11]。

2.2大腸桿菌素K對抗尿路病原性大腸桿菌的作用 大腸桿菌素K對致腎盂腎炎大腸桿菌（UPEC）具有明顯的抑制活性[12]。大腸桿菌素K是編碼細菌形成小的孔隙，造成細菌死亡，有大腸桿菌素ColE1類似質粒的細菌素。菌群中有三個基因編碼大腸桿菌素的產生和釋放：cka為編碼大腸桿菌素的活性，Cki為編碼免疫力，ckl為編碼細胞溶解[13]。

目前已有實驗就大腸桿菌素K的抑菌量及效果進行了研究。大腸桿菌素K在大腸桿菌菌株BL21中表達（DE3）[14]。按照標準實驗室的要求分離菌株，UPEC菌株的分離是從尿路感染尿液細菌培養>105CFU/ml。進行5μm的各種濃度（0.1，1，10，和100μg/ml）的大腸桿菌素K在LB平板上進行對UPEC菌株的抑菌實驗，在37°C培養過夜后，平板用于檢查大腸桿菌素對覆蓋菌株的敏感性。

結果表明，共有68%的測試UPEC菌株敏感和32%對大腸桿菌素K耐藥。然而，在敏感菌株中，對各種不同敏感性進行觀察。結果，18%的菌株由0.1μg/ml抑制，3%的由1μg/ml抑制，16%由10μg/ml抑制，31%由100μg/ml的大腸桿菌素K抑制[12]。基于這些敏感性的不同可能是由于在每個細胞上不同數量的受體[15]。對供試的UPEC菌株，大腸桿菌素K表現出明顯的抑制活性。

2.3大腸桿菌素E1是一個潛在的毒力因子 目前已經在分子水平上分析了26種大腸桿菌素和9種小菌素，并確定相應的基因。通過檢測從泌尿道感染的患者尿液中分離出來的一組361種大腸桿菌和從沒有腸道感染的患者糞便中分離出來的對照組中411種大腸桿菌，一共產生了29種細菌素。結果在泌尿道感染組和對照組中分別檢測到了17種和20種細菌素。與對照組相比，泌尿道感染組中有更多的大腸桿菌株產生大腸桿菌素E1（分別是22.1%和10.2%，P=0.0008）。更重要的是，在泌尿道感染組中產生大腸桿菌素E1的大腸桿菌具有產生多種細菌素的能力[16]。

在泌尿系統感染組中檢測到的361種大腸桿菌其中有195種（54.0%）產生細菌素，這與對照組的細菌素產生率（411種大腸桿菌其中有226種產生細菌素，占55.0%）沒有明顯的區別。產生單一細菌素與產生兩種細菌素的大腸桿菌在泌尿道感染組與對照組中分布相似。（產生一種大腸桿菌素的大腸桿菌分別為48.7%和45.6%，產生兩種細菌素的大腸桿菌的大腸桿菌分別占30.1%和28.2%）。具有編碼三種或三種以上細菌素的大腸桿菌在泌尿系統感染組中更常見（與對照組相比分別是20.0%和12.4%，P=0.03）[16]。

根據Jeziorowski和Gordon的研究表明[17]，當大腸桿菌素Ia和小菌素V同時出現，他們被編碼在同樣的接合質粒上，由于小菌素V操縱子和其他幾種基因整合在pColIa 質粒上。因此，我們測試了是否相似的整合大腸桿菌素E1基因進入到pColIa 可以解釋所觀察到的大腸桿菌E1和大腸桿菌素Ia合成的關系。在隨即挑選的12個大腸桿菌素E1多重產生者里面，所有菌株包含pColE1 DNA通過探針互補大腸桿菌素Ia編碼DNA不能被識別，反之亦然，表明在泌尿道感染的菌株中pColE1與pColIa不相關。更重要的是pColE1的分子量與以前的研究結果相似，（5.2kb；[18]9kb[19]）表明pColE1 DNA不可能編碼某種已知的毒力因子。這個研究結果表明在泌尿系統感染的大腸桿菌群中大腸桿菌素E1本身就是一種潛在的毒力因子[16]。

2.4結合不同大腸桿菌素的抗菌效果 細菌性菌血癥和敗血癥的出現是一個重要的臨床問題。超過40%的菌血癥病例，社區獲得性和醫院獲得性，致病性大腸桿菌是引起死亡的主要原因，造成了巨大的經濟負擔。多數情況下，大腸桿菌敗血癥繼發于尿路感染。

大腸桿菌素的作用要通過不同的受體/轉運系統，并表現出不同的作用機制，大腸桿菌素M抑制肽聚糖合成，E6引起rRNA水解，E7裂解DNA，E1和K形成孔隙，對抗一些從尿路起源菌血癥患者分離大腸桿菌菌株[20]。已知大腸桿菌產生兩種類型的細菌素，根據他們的分子量分為大腸桿菌素（25-80 kDa）和小菌素（10kDa）。大腸桿菌素和小菌素有很多相似的地方。與大腸桿菌素相比，小菌素的合成對產生株是非致命的，不是規定的通過DNA損傷誘導SOS系統。此外，幾乎所有的大腸桿菌素是質粒編碼，而小菌素編碼基因也發現在染色體。 大腸桿菌素起作用的方式：①使膜通透性增加；②核酸酶活性；③抑制肽聚糖和脂多糖O-抗原合成[21]。他們的活動需要結合外膜特定的受體和通過外膜從機械通道Tol 或TonB易位到靶位[22]。還分別測試了聯合三種（E7，K，M）和5種大腸桿菌素（E1，E6，E7，K，M）應用的抗菌效果。研究結果表明，只有組合的大腸桿菌素表現出有效的抗菌活性，排除耐藥演變，小菌素可能導致尿路起源大腸桿菌菌血癥的發展。

測試分離的大腸桿菌素對抗從尿路起源性菌血癥患者105 株大腸桿菌菌株，發現大腸桿菌素E7是最有效的，87%的測試菌株易感。另一方面，32%，33%，43%和53%的測試菌株表現出分別耐大腸桿菌素 E6，K，M和E1，對大腸桿菌素不同程度的易感性可能是由于每個細胞的大腸桿菌素受體數目的不同或由于通過脂多糖O-抗原鏈對受體的保護[23]。大腸桿菌素已被證明對大腸桿菌菌株是有效的，與腹瀉相關的包括血清型O157：H7同樣有效[24，25]。

對大腸桿菌素不敏感的原因包括：①基因突變，廢除或改變大腸桿菌素受體；②由于缺乏大腸桿菌素轉運的功能系統。同時在兩個或多個的受體/轉運系統比一個單一的受體/易位系統更不可能突變。因此，為了判定是否結合大腸桿菌素使用不同的受體，轉運系統和作用方式可以提供有效的抗菌活性，分別結合大腸桿菌素 E7，K，M和E1，E6，E7，K，M在隨后的24h觀察其抑制活性。結合應用三種大腸桿菌素，觀察到再生，當新鮮大腸桿菌素僅用于生長周期的開始∕起始，每隔3h在生長周期各處阻止再生。另一方面，當結合五種大腸桿菌素，沒有觀察到耐藥。

此研究表明，同時應用3種或5種大腸桿菌素，能有效地抑制致病性大腸桿菌菌株的生長，并防止出現耐藥性[20]。但這些都做的體外抑菌實驗，需要用動物實驗來證實其在體內作用的效果。

3展望

大腸桿菌素具有較窄的抗菌譜，對人體有較高的安全性， 大腸桿菌素對致病性大腸桿菌有明確的抑制作用，大腸桿菌素可望被開發為新一代抗菌藥物，治療各種急慢性泌尿系統感染，包括孕期尿路感染，預防醫源性導尿管感染及長期使用導尿管的癱瘓患者的尿路感染。大腸桿菌素對治療細菌耐藥性尿路感染的研究有待進一步深入，對大腸桿菌素的研究有望解決尿路細菌感染耐藥的難題。然而天然的大腸桿菌素從生物體內直接提取純化通常產量低、難度大、效率低、難于制備，難于規模化生產。可以試著用基因工程原核表達、純化提取后進行分析，從而建立生產體系，為新型抗菌藥物的生產提供有效的途徑，如何提高表達效率、減少成本成為基因工程原核表達技術有待解決的問題。而設想用最簡單的組合達到最好的抗菌效果，有待實驗得出結論。

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編輯/申磊