降纖沖劑對肝纖維化大鼠HA、PCⅢ、及IFN—γ的影響

摘要：目的 探討降纖沖劑對復合因素導致的大鼠肝纖維化的防治作用及機理。方法 采用CCL4合并高脂乳劑及酒精等復合因素建立大鼠肝纖維化模型，以易善復為陽性對照，采用光鏡觀察組織學改變，檢測干擾素-γ（IFN-γ）的表達及血清Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、透明質酸（HA）的含量。結果 降纖沖劑組可減輕肝損傷和纖維化變性程度，降低血清中HA、PCⅢ的含量，提高肝組織中干擾素-γ水平。結論 降纖沖劑對實驗性大鼠肝纖維化具有抑制作用。

關鍵詞：降纖沖劑；肝纖維化；干擾素-γ

隨著我國人民生活飲食結構的變化以及臨床診斷技術的不斷提高，各種誘因所致的脂肪肝在我國的診斷率逐年增加。其肝纖維化的發生率約高達25%，且約1.5%～8.0%患者可進展為肝硬化[1]，故積極防治脂肪肝對阻止慢性肝病的進展和改善愈后十分重要。目前西醫尚缺乏理想的針對性治療藥物。相比而言，中醫藥具有療效穩定、持久、無副作用、價廉等優勢，因此深入進行中醫藥治療脂肪肝、預防肝纖維化的臨床及實驗研究是有其現實意義的。

脂肪性肝纖維化多由飲酒過度，或嗜食肥甘厚味，酒食內傷，滋生痰濁所致。因濕濁內停、痰濁阻滯，形成氣機郁滯、血脈瘀阻，致氣、血、痰濁互相搏結、聚滯為積。總治則應以瀉實為主，予祛痰濁、消積滯。降纖沖劑是在長期臨床實踐中摸索創立的經驗效方，具有祛瘀化濁，消導行滯，疏理解郁之效。本課題旨在通過降纖沖劑對肝纖維化大鼠HA、PCⅢ及IFN-γ影響的實驗研究，進一步探討降纖沖劑防治肝纖維化的有效性、可靠性及部分作用機理。

1資料與方法

1.1雄性Wistar大鼠48只，清潔級，體重（150±20）g左右。

1.2藥品和主要試劑 降纖沖劑江蘇省鎮江市中醫院中藥制劑室制備，臨用前用蒸餾水稀釋至所需濃度；易善復膠囊等。

1.3方法

1.3.1分組 將Wistar大鼠適應性喂養1w后，按體重隨機分成四組，即：正常對照組、降纖沖劑組、易善復組及模型組各12只。

1.3.2造模與實驗 每天上午給模型組、降纖沖劑組、易善復組每只按1ml/100g體重灌服乳劑（按配方：3號膽鹽10g，膽固醇40g，豬油80g，吐溫-80 40ml，丙二醇40ml，蔗糖80g，加30°酒精至600ml），正常組灌服等量蒸餾水，并每間隔2d按每只0.2ml/100g體重腹腔注射25% CCL4油液一次，正常組注射同樣生理鹽水。每天下午按1ml/100g體重給降纖沖劑組灌服藥物，按1ml/100g體重給易善復灌服藥物，模型組和正常組灌服蒸餾水，連續8w。并于第8w末次給藥后禁食。

1.4觀察指標

1.4.1血清肝纖維化指標的測定 采用放射性免疫實驗方法，按試劑盒說明書要求在放射免疫計數器上測定各組大鼠血清透明質酸（HA）、Ⅲ型膠原（PCⅢ）。

1.4.2肝組織病理學觀察 將10%甲醛溶液固定后的肝大葉常規石蠟切片，HE染色，置顯微鏡下觀察肝細胞變性情況，依據六版內科學教材分級標準，將肝炎病變依炎癥活動度及纖維化程度分別分為1～4級和1～4期，前者又將匯管區周圍炎癥（界面炎）與小葉內炎癥分為兩項，分別按程度定級，當兩項的程度不一致時，總的炎癥活動度以高者為準。

1.4.3血清細胞因子的測定 將大鼠肝組織石蠟包塊4um連續切片，采用免疫組化染色法，按試劑盒操作說明進行。結果評定的分級標準[2]：陽性染色者在細胞漿或（和）細胞膜呈現淡黃、棕黃、棕褐色顆粒沉著。根據染色程度及染色細胞百分率進行分析評定：基本不著色者為0分，著色淡黃者為1分，棕黃色者為2分，棕褐色者為3分；著色細胞占計數細胞百分率：5%以下為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%以上為3分。將每張切片染色程度與染色細胞百分率得分各自相乘，0分為（-）、1～3分為（+）、4～6分為（++）、7～9分為（+++）。

1.5統計方法 采用PEMS3.1軟件包進行統計。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較用方差分析，等級資料采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性。

2結果

2.1實驗大鼠一般狀況 實驗過程中正常對照組大鼠精神良好，行動靈敏，毛發光澤，飲食、二便正常，體重增加較快。實驗初大鼠注射CCl4表現為煩躁、易激惹。約3w后，所有造模動物均趨于平靜、皮毛晦暗無光澤甚至脫毛、活動及飲食減少、糞便稀薄、體重增長緩慢。與模型對照組相比，易善復組與調脂積組癥狀較輕。

實驗第3w末，由于技術原因，在灌胃過程中，降纖沖劑組出現1只死亡大鼠。在第6w末于模型組中隨機抽取一只大鼠，處死后取肝臟做病理切片，顯示少量纖維細胞增生，變性明顯，無壞死，無假小葉樣結構。于第8w的第3d，再次從模型組中隨機抽取一只大鼠，處死后取其肝臟做病理切片，顯示肝臟細胞部分變性壞死，匯管區纖維細胞增生，伴少量淋巴細胞浸潤，部分中央靜脈偏位，假小葉樣結構形成。提示造模成功。故于第8w末處死全部大鼠。

2.2實驗大鼠肝纖維化指標改變，見表1。

2.3肝臟肉眼觀察和組織病理變化 肉眼觀察結果：正常對照組大鼠肝臟色澤均勻，暗紅，質軟，表面光滑，邊緣銳利，肝臟與腹膜之間無粘連，葉與葉之間分葉清楚；模型對照組大鼠肝臟體積普遍增大，色澤不均勻，暗黃，質韌，表面欠光滑，略呈顆粒狀，邊緣較鈍，肝臟與腹膜之間、肝葉與葉間均有粘連；降纖沖劑組和易善復組大鼠均可見肝臟色澤均勻，暗紅，體積略增大，表面尚光滑，邊緣略鈍，肝臟與腹膜之間、肝葉之間少量粘連。

光鏡： 正常對照組肝小葉結構完整，肝細胞索排列整齊，肝細胞無明顯變性壞死，匯管區無擴大，未見纖維組織增生及炎性細胞浸潤。模型對照組肝細胞彌漫變性，以空泡變性和嗜酸性變為主，壞死以小灶性壞死、橋接壞死為主，中央靜脈和匯管區炎性細胞浸潤，纖維間隔及假小葉形成，小葉結構紊亂。降纖沖劑組和易善復組肝小葉結構尚存，少數切片可見不完整假小葉形成，多數未見明顯假小葉結構，肝細胞變性以少量空泡變性為主，散在小壞死灶，匯管區少量炎細胞浸潤，以淋巴細胞為主，纖維組織增生不明顯，見表2，表3。

2.4肝組織干擾素-γ水平測定的比較，見表4。

3討論

肝纖維化是慢性肝病重要的病理特征，近年來國內外學者對其進行了廣泛深入地研究，認識到它是肝損傷持續存在時肝內細胞-細胞、細胞-基質、基質-細胞因子形成的復雜網絡系統間相互作用的結果。參與肝纖維化的細胞外基質包括膠原、非膠原糖蛋白和蛋白多糖三大類，PCⅢ及HA分別做為膠原、蛋白多糖的代表，對肝纖維化的診斷意義已得到廣泛認可[3，4]。IFN-γ是機體在免疫應答中，由抗原特異性細胞和NK細胞產生的具有高度生物活性的免疫調節因子，是肝纖維化的主要抑制因子。其抗肝纖維化的機制尚不甚清楚，多數學者認為主要通過以下兩種途徑：①IFN-γ降低成纖維細胞I、III型前膠原mRNA水平，使膠原合成減少。②IFN-γ抑制HSC的增生和活化，從而減少ECM的合成。原代培養的HSC加入IFN-γ1000 U·L/ml后，其Ⅰ、III型膠原的mRNA水平分別降低3%和24%。在培養激活的星狀細胞中加入IFN-γ后，細胞內α-SMA mRNA表達下降，細胞增殖下降，合成的ECM功能低下[5]。此外IFN-γ還與其他多種細胞因子相互作用阻止ECM的沉積，有研究發現IFN-γ對促進TGF- β的轉錄具有拮抗作用[6]。總之，IFN-γ是肝纖維化過程中的重要參與因子，對纖維化的抑制作用是復雜的。

本實驗采用CCL4 合并高脂乳劑及酒精等復合因素建立大鼠肝纖維化模型，該模型在發病機制、組織病理學等方面與目前常見的人脂肪性肝纖維化相似，且較單因素制備的周期短，成模比例高。在實驗中我們發現，降纖沖劑組肝纖維化大鼠與易善復組比較各項指標均無明顯差異；與模型組比較，該組大鼠血清中HA、PCⅢ的含量下降，肝組織中IFN-γ水平顯著提高，肝組織中炎癥活動度和纖維化程度亦明顯下降。說明降纖沖劑有防治肝纖維化的作用，其作用機制的發揮是通過減少細胞外間質中的蛋白多糖和膠原的生成，阻止ECM沉積，減輕肝組織炎癥反應，減少纖維增生等多種途徑。本實驗造模同時即給予藥物預防，證實降纖沖劑具有較好的抗肝纖維化作用。在撤除了致病因素后該復方是否可以促進纖維消退、肝小葉重新恢復、各指標恢復正常，達到逆轉之效，尚有待進一步的觀察和研究。

參考文獻：

[1]曾民德. 脂肪肝[J].中華消化雜志，1999，19（2）：120-122.

[2]李萍，謝金鮮，林啟云，等.余甘子抗慢性肝損傷性肝纖維化的實驗研究[J].中西醫結合肝病雜志，2002，12（6）：355.

[3]馮新利，徐貴平，歐陽艷.肝纖維化血清學診斷方法的研究進展[J].放射免疫學雜志，2003，16（2）：111.

[4]潘繼承，朱建一，呂志剛，等.Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原、透明質酸及層粘連蛋白在診斷肝纖維化中的意義[J].臨床檢驗雜志，2005，23（2）：143-144.

[5]Rockey DC， John HA. Hepatol，1992，16（4）：776.

[6]姚禎.肝纖維化的分子機制[J].日本醫學介紹，2002，23（5）：230.

編輯/申磊