淫羊藿對LARS韌帶周圍成骨細胞堿性磷酸酶活性影響的研究

摘要：目的 觀察淫羊藿對LARS韌帶周圍成骨細胞堿性磷酸酶（ALP）活性影響。方法 將Wistar乳鼠顱骨原代分離培養的成骨細胞接種于nHA、LARS韌帶及nHA介導的LARS韌帶的表面，同時用淫羊藿去干預，21d時檢測ALP活性。結果 nHA表面上ALP活性最高，LARS韌帶表面ALP活性最低，LARS韌帶介導的nHA表面上ALP活性略高于空白組，但無顯著性差異，但當淫羊藿干預后有了顯著性差異。結論 淫羊藿結合nHA能明顯增加LARS韌帶周圍ALP的活性，促進成骨細胞的功能及代謝活動。

關鍵詞：LARS韌帶； 納米羥基磷灰石；堿性磷酸酶；淫羊藿

1 資料與方法

1.1淫羊藿提取液淫 羊藿生藥購自同仁堂集團公司。淫羊藿提取液按高子范等[1]的方法制備，提取液相當于1.5g/ml生藥。

1.2納米羥基磷灰石制備：①取Ca（NO3）2·4H2O78.7g，加300 ml去離子水配制溶液，加10ml30% 氨水，將pH值調至11～12，稀釋到600ml。②取（NH4）2HPO4 26.4g ，用500m去離子水配成溶液，加30%氨水250 ml，將pH調值至11～12，再稀釋至1067ml，將沉淀物溶解，測pH值，加30%氨水，使其pH值保持在11～12。③在25℃條件下，將（NH4）2HPO4加至Ca（NO3）2溶液中，同時劇烈攪拌20min，加完后再繼續劇烈攪拌24h。④抽濾反應物，無水乙醇洗滌3次，在90℃條件下干燥15h。⑤把干燥樣品放入高溫爐中煅燒，在1100℃保溫1h，再冷卻至室溫，得到HA粉體。將HA粉體制備成直徑10mm、厚2 mm 的圓片型，從室溫至1200℃的條件下燒1h，得到納米HA（nHA） 。

1.3 骨細胞的分離與培養 新生24h以內的Wistar大鼠乳鼠，用75%乙醇浸泡5min。取出顱骨，去凈表面的骨膜及軟組織， 再浸入DMEM 培養液中， 沖洗2次。在培養皿中剪碎為0.5mm×0.5mm碎片。加0. 25%Ⅰ型膠原酶1ml和PET液5 ml，在孵箱中消化20min，反復吹打，棄上清液，此操作反復3次，取第3次消化后的上清液，于4℃離心5min（1000 r/min），至細胞沉淀。棄上清液，入完全培養液懸起細胞沉淀， 并洗細胞2 次，臺盼蘭染色顯示90%以上細胞存活。將細胞懸液于25 ml培養瓶中，密度為5. 0× 104 / ml，于37℃飽和濕度， 5%CO2 的孵箱中培養。24h后換液，以后隔日要換液1次。將傳到第3代的成骨細胞用0.25%胰蛋白酶消化脫壁， 制成懸液， 4℃離心收集細胞，用于接種在實驗中各組材料上。

1.4 實驗分組 實驗分為6組， 即LARS韌帶組、LARS韌帶加淫羊藿組、nHA 組、內放nHALARS韌帶（nHA-LARS）組、nHA-LARS加淫羊藿組及空白組，其中空白組為Φ10mm圓形載玻片。

1.5 細胞接種 在96孔培養板中分別放LARS韌帶組、LARS韌帶加淫羊藿、nHA 、nHA-LARS、nHA-LARS加淫羊藿以及空白組的圓形載玻片，其中淫羊藿濃度20mg/L，每組4 孔，將傳代第3 代的成骨細胞接種至材料的表面（ 密度1.5×104/ ml ），靜置片刻后緩慢加入完全培養液1 ml，密閉后置于37℃飽和濕度， 5%CO2 的孵箱中密閉培養7d。

1.6 細胞裂解液制備 成骨細胞接種后第21d將培養板各孔內上清液吸出， PBS 洗去未附著的細胞， 用蒸餾水洗3 次，三次凍融培養的細胞， 吸管反復吹打各孔中細胞1 min，從而制成不同組份的細胞裂解液。

1.7 堿性磷酸酶活性的測定 以上每組10只試管，各試管加100μl上述細胞裂解液， 細胞裂解液與ALP檢測試劑盒內500μl反應液混合之后，37℃恒溫下反應30 min，變成黃色后加入0.25N NaOH1.5ml終止反應。用MR600紫外光分光光度計于400nm波長處測定溶液的光吸收值。以蒸餾水為空白對照、以對硝基苯酚為標準品繪制標準曲線。依據標準曲線推算各實驗組成骨細胞內堿性磷酸酶含量（nmolp-nitrophenol/min/mg·pro 表示）。

1.8 統計學方法 SPSS13.0統計分析軟件，計算各組數據的均值和標準差，方差分析比較各組間差異，以P<0.05為有統計學意義。

2結果

nHA表面上ALP活性最高，LARS韌帶表面ALP活性最低，nHA介導的LARS韌帶表面上ALP活性略高于空白組，但無顯著性差異，但當淫羊藿干預后有了顯著性差異（ P<0.05）（見表1）。

3討論

近來研究發現，淫羊藿具有促進骨骼生長，阻止鈣質流失，預防骨質疏松的作用[2]。納米羥基磷灰石由于表面效應使其表面原子存在許多懸空鍵，有很高的化學活性，可增加材料生物活性和成骨誘導的能力。實驗結果顯示，淫羊藿結合納米羥基磷灰石能明顯增加LARS韌帶周圍ALP的活性，促進成骨細胞的功能及代謝活動，為臨床促進LARS韌帶在骨隧道內與骨愈合的研究提供了一種思路。

參考文獻：

[1] 高子范，揚宗智，馬克昌，等.淫羊藿提取液對試管內雞胚股骨生長的促進作用[J].中西醫結合雜志， 1985， 5： 172 - 173.

[2] 殷曉雪，陳仲強，黨耕町，等.淫羊藿苷對人成骨細胞增殖與分化的影響[J].中國中藥雜志， 2005， 30： 289- 291.

編輯/王海靜