高效液相色譜法測定頭孢地尼及制劑中聚合物的含量

摘要：目的 采用聚苯乙烯高效液相色譜法檢查頭孢地尼中聚合物的方法。方法 色譜柱為聚苯乙烯凝膠為填料的TSKgel G2000SWxl（7.8 mm×300 mm 5um）色譜柱，流動相為0.1 mol/L，pH=7.0緩沖溶液-甲醇（95∶5），流速為0.5 mL/min，檢測波長285 nm，通過HPLC-ESI-MS法鑒定高分子雜質峰，并對其結構進行推定。結果 頭孢地尼在0.0002～1.5 mg/mL濃度范圍內與峰面積呈良好線性關系（r=1.0000）最小檢測濃度為0.2 ug/mL，聚合物雜質與頭孢地尼能有效分離，并先于主峰流出，方法專屬性良好，樣品在溶液中不穩定，需臨用新配。結論 建立的方法快速準確。適用于頭孢地尼及其聚合物的測定。

關鍵詞：高效液相色譜；聚苯乙烯凝膠；頭孢地尼；聚合物；β-內酰胺類抗生素；過敏原

頭孢地尼為半合成的第三代口服頭孢菌素，屬于β-內酰胺類抗生素，具有抗菌譜廣、療效高、毒性低等特點。β-內酰胺抗生素是目前臨床上最常用的抗感染藥物[1]。研究證明，引發過敏反應的過敏原不是抗生素本身，而是其中的高分子雜質，因此國內外對β-內酰胺類抗生素的高分子雜質的控制非常重視。2010版中國藥典已有22個品種43個標準的控制[2]。

中國藥典2010年版已采用葡聚糖G-10自身對照外標法對大部份常用注射用頭孢類抗生素進行了高分子雜質控制，也有文獻報道使用葡聚糖G-10用于頭孢地尼聚合物的測量[3]。葡聚糖G-10可以手工填裝，也有商品化色譜柱，使用該填料的分離的色譜峰拖尾嚴重，不利于該產品聚合物的測定。日本藥典（JP）對頭孢卡品酯采用以苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為基礎的TSKgel G2000 色譜柱進行聚合物控制。也有文獻報道使用國產的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為基礎的，以分子排阻為主要分離機制，用于測定頭孢呋辛酯中高分子聚合物的檢查[4]。

因此我們采用苯乙烯為填料的TSKgel G2000SWxl色譜柱。

1儀器與試藥

液相色譜儀，檢測器： Waters2998，溶液輸送泵：Waters2695，柱溫箱：Waters Corporation工作站：Empower版本6.20。

2色譜條件

色譜柱，TOSOH TSKgel G2000SWxl （300mm）；柱溫：35℃恒溫。流速：0.5 mL/min。

3溶液的制備

3.1對照品溶液的制備 取頭孢地尼對照品適量，精密稱定，用0.1 mol/L pH=7.0緩沖液制成含頭孢地尼對0.01 mg/mL的溶液。

3.2供試品溶液的制備 取樣約品10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加0.1 mol/L pH=7.0緩沖液稀釋至刻度搖勻。

4色譜條件的選擇與優化

4.1流動相組成的選擇 去頭孢地尼對照品適量，精密稱定，用pH=7.0緩沖溶液稀釋成1 mg/mL的溶液，在25℃放置48 h，精密量取10 μL，分別用表1中的四種流動相進行分析，色譜圖如圖所示，用頭孢地尼主成分與其檢出雜質、分離度、峰面積及總分析時間為分析指標，發現上述五種色譜系統中，0.1 mol/L pH=7.0緩沖溶液-甲醇（95∶5），作為流動相時，各項指標最優，故選用0.1 mol/L pH=7.0緩沖溶液-甲醇（95∶5）作為流動相，見圖1。

4.2流速的影響 在0.1 mol/L pH=7.0緩沖溶液-甲醇（95∶5）色譜系統中，考察選流速對色譜分離的影響，結果顯示流速為1.0ml/min時，雜質峰與主成分峰不能有效分離，當流速降為0.5 mL/min時，各峰的分離度良好，雜質峰的保留時間為22.067 min主峰流出在25.010 min之后，在30 min內，完成一個樣品分析，典型的色譜圖，見圖2。

4.3柱溫的影響 取供試品溶液按2.1項下的方法，分別在25℃、35℃、50℃下進行測定，結果在35℃時主成分與雜質鋒的分離效果和對稱性最優。

5專屬性考察

5.1聚合物的結構鑒定 采用LC-ESI-MS法，測定系統適用性考察用溶液中高分子聚合物的分子量，通過對待測樣品LC分析，樣品中有少量雜質峰，根據相關文件報道，猜測其是頭孢地尼的低聚物。對強度較大的813.0，791.0，828.9峰分析，它們分別對應與二聚加鈉峰，二聚加鉀峰，見圖3。

5.2強力破壞樣品中聚合物的分離 取本品原料適量，分別經強酸（0.1 mol/L HCl）沸水浴，強堿（0.1 mol/L NaOH）沸水浴， 過氧化氫沸水浴，加熱破壞處理，光照，綜合后分別用流動相稀釋成0.2 mg/mL的供試品溶液。取10 uL按上述色譜條件進行分離。結果表明，在上述色譜系統下，各種破壞試驗均能使聚合物峰增大，以堿破壞和氧化破壞最為明顯，各峰分離度良好。溶劑不干擾頭孢地尼及其高分子雜質的測定。表明該方法的專屬性良好。

5.3輔料的干擾 取空白輔料，按片劑的配方除主成分外的混合輔料，按3.1供試液制備的方法配制空白輔料溶液，搖勻，取續濾液。立即精密量取10 uL，按照樣品測定方法測定，結果表明，在該色譜條件下輔料在286 nm檢測波長下均不出峰，對高分子雜質的色譜行為不產生干擾。

5.4線性與范圍 精密稱取頭孢地尼對照品適量，用0.1 mol/L pH=7.0緩沖液稀釋制成每1 mL中含頭孢地尼分別為0.0005、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1和1.5mg的對照品溶液，進樣10 uL，用2.1的色譜條件測定。以頭孢地尼的峰面積（A）對其濃度（C）進行線性回歸，得線性方程A=65099678.3C-109555.5結果表明，頭孢地尼在0.0002～1.5 mg/mL濃度范圍內與峰面積呈良好線性關系r=1.0000。

5.5精密度 取連續進樣6次，1 mg/mL的對照品溶液，測峰面積，相對標準差RSD為0.32%，表明方法精密度良好。

5.6最低檢測限 精密量取頭孢地尼對照品適量用0.1 mol/L pH=7.0緩沖液溶解，逐級稀釋后進樣10 uL，按S/N=3作為檢測限，記錄色譜圖，最低檢測濃度約為0.2 ug/mL，靈敏度良好。

5.7供試品濃度與聚合物測定結果性關系考察 按3.1配制供試品溶液分別用0.1 mol/L pH=7.0緩沖液稀釋制成0.01、0.02.、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5mg的溶液，搖勻，精密量取10 uL按樣品測定方法測定，結果表明在0.01～1.5 mg/mL濃度范圍內，聚合物峰面積與頭孢地尼主峰相關性良好，相關系數為r=1.0000。

5.8樣品測定 精密稱取頭孢地尼片樣品粉末適量，用0.1 mol/L pH=7.0緩沖液稀釋并制成約含1 mg/mL的溶液。按文中所提的方法進行實驗，3批樣品測定結果，見表2。

6討論

以苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為基礎的TSKgel G2000該色譜柱以分子量排阻為主要分離機制，有別于其他聚合物基質的色譜填料，具有耐高壓，耐酸堿的特點，對水溶性和有機溶劑流動相均適用。今后可以適用于其他β-內酰胺類抗生素中聚合物的測定。

在PDA全波長掃描下，檢測系統適用性溶液，所得雜質及主成分的最大吸收在285 nm，主成分峰的最大吸收為285 nm，故選擇285 nm為檢測波長。較之普通聚合物采用單一檢測波長254 nm更具有合理性

參考文獻：

[1]金少鴻，胡昌勤，仇士林，等.β-內酰胺類抗生素過敏反應的研究[J].醫學研究通訊，2002，31（4）：22-23.

[2]國家藥典委員會.中國藥典，2010二部附錄VH[S].北京：中國醫藥科技出版社，2012.

[3]謝贊，陳玉潔，李坤，等.凝膠色譜法測定頭孢地尼的聚合物[J].中國抗生素雜志，2011，36（3）：214-215.

[4]侯玉榮，袁耀佐，張玫，等.高效凝膠色譜法測定頭孢呋辛酯及制劑中高分子雜質的含量[J].藥物分析雜志，2012，32（2）：267-268.編輯/張燕