高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定大鼠體內(nèi)和厚樸酚與厚樸酚

摘要：目的 建立高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中和厚樸酚與厚樸酚的方法，以測(cè)定大鼠直腸給藥（厚樸提取液）后和厚樸酚與厚樸酚的血藥濃度-時(shí)間曲線。方法 采用Hanbon Hedera ODS-2色譜柱，流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（83：17：0.1），流速：0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm，柱溫：35 ℃；0.1 mL血漿加入2倍量含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液沉淀蛋白，再加入氯化鈉分離水層，取上層有機(jī)相進(jìn)樣分析。結(jié)果 和厚樸酚與厚樸酚的檢測(cè)限分別為15和30 ng/mL，和厚樸酚在20～200 ng/mL、厚樸酚在40～400 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，提取回收率均大于92%，RSD均小于15%。結(jié)論 本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于大鼠血漿中和厚樸酚與厚樸酚濃度的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：HPLC；和厚樸酚；厚樸酚

厚樸為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd. et Wils. 或凹葉厚樸M. officinalis Rehd. et Wils.var. biloba Reht et Wils.的干燥根皮、枝皮及干皮[1]。主要化學(xué)成分為和厚樸酚、厚樸酚等木脂體類化合物，藥理作用明顯，臨床應(yīng)用廣泛。其主要成分體內(nèi)過(guò)程研究不多，文獻(xiàn)報(bào)道的同時(shí)測(cè)定大鼠服用厚樸類成分后血漿中和厚樸酚與厚樸酚的方法前處理較繁瑣或色譜條件較復(fù)雜，本文旨在建議一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的測(cè)定方法，為其體內(nèi)過(guò)程研究提供幫助[2～4]。見(jiàn)圖1。

1材料與儀器

和厚樸酚、厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)分別為110730-201313、110729-200412，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院）；內(nèi)標(biāo)聯(lián)苯（購(gòu)自Sigma公司） ；厚樸（購(gòu)自山東省醫(yī)藥公司，經(jīng)鑒定為Magnolia officinalis Rehd. et Wils）；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；水為純化水，其他為分析純。高效液相色譜儀（Agilent 1100，美國(guó)安捷倫）；旋渦混合儀（上海醫(yī)科大學(xué)儀器公司）；臺(tái)式離心機(jī)（上海醫(yī)療器械有限公司）；電子天平（Sartorius BP 211D，德國(guó)賽多利斯）。Wistar大鼠，雄，8周齡，280～320 g （山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Hanbon Hedera ODS-2（4.6×150mm，5 m，江蘇漢邦科技有限公司）；柱溫：35℃；流動(dòng)相：甲醇-二氯甲烷-水-磷酸（81：3：16：0.1）；流速：0.5mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：590nm；進(jìn)樣量：20μL[5]。

2.2血樣采集與樣品預(yù)處理 試驗(yàn)前大鼠禁食12 h，不禁水，乙醚麻醉后埋置股動(dòng)脈留置針。至少蘇醒1h后直腸給藥（厚樸用40%乙醇提取，每只大鼠按 245mg/kg，相當(dāng)于13.5、24.4mg/kg的和厚樸酚與厚樸酚給藥，共6只大鼠）。采集0min和給藥后10，20，30，45，60，90，120，180，240和360 min的全血各0.25 mL，置肝素化塑料離心管中，離心分離得血漿樣品。

取0.1mL血漿樣品，加入0.2 mL乙腈渦旋5 min沉淀蛋白，15600 r/min離心5 min，取上清置另一1.5mL塑料離心管中，加入氯化鈉60mg，混勻后靜置10 min，于15600 r/min離心5min，取上層有機(jī)相20μL進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相色譜分析。

2.3方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1專屬性 本試驗(yàn)所采用的色譜條件下，和厚樸酚保留時(shí)間為6.2 min左右，厚樸酚保留時(shí)間為8.2 min左右；內(nèi)標(biāo)（聯(lián)苯）的保留時(shí)間為10.1 min左右。見(jiàn)圖2，待測(cè)成分和內(nèi)標(biāo)峰形良好，無(wú)雜峰干擾測(cè)定。

2.3.2線性范圍和最低定量限 精密稱取和厚樸酚與厚樸酚對(duì)照品適量，以甲醇-水（6：4）溶解，制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；取0.1 mL大鼠空白血漿若干份，加入上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，制成含和厚樸酚為20、40、60、80、100、150、200ng/ml，厚樸酚為40、60、80、100、150、250、400ng/ml的含藥血漿。按\"2.3.1\"的方法處理后進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖，計(jì)算待測(cè)成分的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值f。以峰面積比值f分別對(duì)待測(cè)成分的血藥濃度C作權(quán)重回歸計(jì)算。得典型回歸方程（和厚樸酚：f =0.0021×C-0.0186，r2=0.9968；厚樸酚：f = 0.0022 ×C-0.0253，r2=0.9960）。此條件下，和厚樸酚與厚樸酚的檢測(cè)限分別為15和30 ng/mL。

2.3.3精密度和提取回收率 取大鼠空白血漿若干，制備含和厚樸酚和厚樸酚濃度分別為50、100、180，50、200、350 ng/ml的含藥血漿樣品，按\"2.2\"操作，共做3批，每個(gè)濃度各配制5份。制備空白血漿提取液若干，加標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，配成和厚樸酚和厚樸酚濃度分別為50、100、180，50、200、350 ng/mL的提取回收率對(duì)照品，取一批精密度樣品作為提取回收率樣品，按\"2.1\"條件測(cè)定。結(jié)果表明：待測(cè)成分的批內(nèi)和批間樣品的RSD均小于15%，精密度符合要求，提取回收率均大于92%，見(jiàn)表1。

2.4應(yīng)用 按\"2.1\"和\"2.2\"的方法操作，測(cè)定給藥后采集的大鼠血漿樣品，得血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3。

參考文獻(xiàn)：

[1]中國(guó)藥典.一部[S].2010：235.

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[5]趙陸華.高效液相色譜法分析中藥成分手冊(cè)[M].北京：中國(guó)科技醫(yī)藥出版社，1994，443.

編輯/許言