拉薩地區產ESBLs大腸埃希菌檢測及基因型分析

摘要：目的 了解拉薩地區大腸埃希菌臨床分離菌株產ESBLs情況及其主要基因型分布。方法 參照2009年CLSI推薦方法對拉薩市臨床醫院細菌感染性疾病臨床標本中分離所獲56株大腸埃希菌進行ESBLs表型檢測及確證，采用PCR擴增法檢測TEM、SHV、CTX-M型ESBLs基因在試驗菌株中的分布。結果 56株大腸埃希菌臨床菌株中共檢出產ESBLs菌株22株，檢出率為39.29%；PCR擴增分析顯示TEM、SHV、CTX-M型ESBLs基因檢出率分別為40.91%、27.27%、4.55%。結論 拉薩地區產ESBLs大腸埃希菌檢出率略低于國內其他地區，ESBLs基因型以TEM型和SHV型為主。

關鍵詞：拉薩；大腸埃希菌；ESBLs

自20世紀40年代以來，隨著各類抗生素的研制和廣泛使用，細菌的耐藥性也廣泛出現。目前，細菌耐藥已成為一個全球性的公共衛生問題。大腸埃希菌是臨床細菌性感染的常見病原菌，占臨床細菌感染標本總檢出構成比的18，3%，居首位[1]，其抗生素耐藥的重要機制之一為超廣譜β-內酰胺酶（extended spectrumβ-lactamases，ESBLs）的產生。ESBLs是指由質粒介導的能賦予病原菌對頭孢菌素類（如頭孢噻肟、頭孢三嗪和頭孢他啶等）和單酰胺酶類抗生素、氨曲南以及青霉素耐藥的一類β-內酰胺酶，主要分為五類：TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型及其他型，其中TEM、SHV、CTX-M型最為常見，不同地區ESBLs基因分布類型不盡相同[2]。為了解拉薩地區臨床大腸埃希菌產ESBLs及其主要基因型分布情況，本研究對拉薩市2010～2012年三家臨床醫院細菌感染性疾病臨床標本中分離所獲的56株大腸埃希菌進行了ESBLs表型檢測，并對其ESBLs基因型進行分析，現將結果報告如下。

1資料與方法

1.1菌株 本院病原生物學實驗室2010～2012年自西藏自治區第二人民醫院、拉薩市人民醫院及婦幼保健院細菌感染性疾病臨床標本（類型包括：痰液、尿液、化膿性傷口分泌物、膿腫液、血液等）中分離所獲大腸埃希菌56株，菌種鑒定及藥物敏感性試驗質控菌株ATCC25922，購自衛生部臨床微生物檢驗中心，本院病原生物學實驗室保存。

1.2主要材料及儀器 藥敏紙片、MH瓊脂購自英國Oxoid公司，在有效期內使用。細菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq Plus PCR MasterMix、DNA Marker、Goldview、瓊脂糖為北京天根生物產品。ATB Expression 菌種鑒定儀（法國生物梅里埃），PCR擴增儀及電泳凝膠成像系統（美國BIORAD公司）。

1.3菌種鑒定和藥敏試驗 采用ATB Expression 菌種鑒定儀對試驗菌株進行鑒定，56株試驗菌株均為大腸埃希菌。參照2009年美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）推薦的Kirby-Bauer紙片擴散法進行抗菌藥物敏感性試驗及雙紙片擴散法進行表型確證。CAZ和CAZ/CLA及CTX 和CTX/CLA兩組紙片中任何一種紙片抑菌圈直徑比相應不含克拉維酸紙片抑菌圈直徑≥5mm，則判定為產ESBLs菌株。

1.4耐藥基因檢測

1.4.1模板DNA的制備 取適量產酶菌株普通瓊脂平板過夜培養菌落混懸于5ml無菌 0.9%NaCl溶液中，12000rpm離心5min棄上清，其后步驟按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明書進行。制備之基因組DNA -80℃存放備用。

1.4.2 PCR引物及PCR反應 根據Genebank報道的各型ESBLs基因序列設計TEM、SHV及CTX-M基因擴增引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列及擴增預期片段大小見表1。反應體系25μl，包括2×Taq Plus PCR MasterMix 15μl，上下游引物各1.5μl，模板DNA 2μl，去離子水5μl。各基因PCR擴增條件：95℃預變性5min，95℃變性1min，退火30s（TEM、SHV及CTX-M基因退火溫度分別為56℃、52℃及56℃），72℃延伸1min，40個循環，末次循環72℃延伸5min，反應結束后4℃放置。

1.4.3瓊脂糖凝膠電泳 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測各ESBLs基因PCR擴增產物，凝膠成像儀拍照并進行分析。

2結果

2.1 ESBLs檢出率 共檢測大腸埃希菌56株，檢出產ESBLs菌株22株，占39.29%。其中CAZ、CAZ/CLA組，CTX、CTX/CLA組檢出率分別為35.71%（20/56）和33.93%（19/56），兩組均檢出者有17株。

2.2 PCR擴增結果及基因型分布 部分產ESBLs菌株TEM、SHV、CTX-M基因PCR擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。擴增所獲片段大小與設計一致。22株產ESBLs大腸埃希菌中TEM型陽性9株，SHV型陽性6株，CTX-M型陽性1株，TEM+SHV型陽性4株，所占產ESBLs菌株比例分別為40.91%（9/22）、27.27%（6/22）、4.55%（1/22）和33.33%（4/22）。

3討論

隨著第三代頭孢菌素的廣泛使用，產ESBLs菌株檢出率也在不斷地增多。ESBLs主要由腸桿菌科細菌產生，尤以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌最為多見。產ESBLs大腸埃希菌株和肺炎克雷伯菌株不僅對第一、二、三代頭孢菌素耐藥， 而且對氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類等交叉耐藥。目前，產ESBL 菌株引起的耐藥已經成為全球最重要的醫院內耐藥問題之一，給臨床治療和預防帶來了巨大的挑戰。

本研究共檢測臨床分離大腸埃希菌菌株56株，產ESBLs陽性22株，產ESBLs檢出率為39.29%。其表型確證實驗結果顯示，以CAZ、CAZ/CLA組檢出模式陽性率最高，占35.71%；兩組均陽性者占30.36%。該結果較國內其他地區50%～70%的大腸埃希菌產ESBLs檢出率低[3]。抗菌藥物的大量使用是細菌形成耐藥性甚至多重耐藥的重要誘因，不同地區及醫院使用三代頭孢菌素類的種類、數量及時間等不盡相同，臨床菌株的耐藥表型亦會存在差異。由于西藏地處祖國邊陲，三代頭孢菌素使用相對較少且品種較為單一，這可能是導致拉薩地區臨床大腸埃希菌產ESBLs檢出率低于國內其他地區的主要原因。

ESBLs基因型分布結果顯示，22株ESBLs表型確證陽性的菌株中TEM型和SHV型分別占40.91%和27.27%，為拉薩地區臨床產ESBLs大腸埃希菌的主要基因型，CTX-M型僅檢出一株占4.55%（1/22）。產ESBLs的細菌呈世界性分布，但由于不同地區藥物使用不同等原因，其流行基因型也不盡相同。文獻報道在北美地區流行的主要基因型是TEM和SHV型[4]。日本主要是Toho-2組和CTX-M型酶。我國寧夏、廣州等地大腸埃希菌ESBLs基因主要為SHV和TEM型[5]，也有主要為CTX-M型的報道[6]，我們的檢測結果顯示拉薩地區臨床大腸埃希菌ESBLs的主要流行型別為TEM和SHV型。另外，由于ESBLs基因種類眾多，在我們所檢測的22株菌株中TEM、SHV及CTX-M型別均為陰性的6株菌株可能為其他型別，具體的基因種類需進一步研究確定。

本研究所使用菌株數量相對較少，來源也僅局限于拉薩市的三家臨床醫院，故尚不能夠全面反映出拉薩地區臨床大腸埃希菌株產ESBLs情況，但該研究對拉薩地區臨床醫師合理使用抗生素，控制耐藥菌株的形成及蔓延仍具有一定的實踐意義。

參考文獻：

[1]肖永紅，沈萍，魏澤慶，等.Mohnarin 2011年度全國細菌耐藥監測[J].中華醫院感染學雜志，2012，22（22）：4946-4952.

[2]Shah A A， Hasan F， Ahmed S， et al. Characteristics， epidemiology and clinical importance of emerging strains of Gram negative bacilli producing extended spectrum beta-lactamase [J]. ResMicrobiol， 2004，155（6）：409-421.

[3]張永標，張扣興，唐英春，等.產質粒介導AmpC酶和ESBLs細菌的耐藥性及β-內酰胺酶基因型研究[J].中華微生物學和免疫學雜志， 2004，24（7）：577-582.

[4]Minarini L A， GalesA C， Palazzo IC， et al. Prevalence of community occurring extended spectrum beta-lactamase producing Enterobacteriaceae in Brazil[J]. CurrMicrobiol，2007，54（5）：335-341.

[5]肖慶忠，蘇丹虹，江潔華，等.廣州地區3500株革蘭陰性桿菌TEM和SHV產超廣譜β-內酰胺酶基因分型研究[J].中華檢驗醫學雜志，2005，28：1010-1014.

[6]杜軍，李敏，崔景榮，等.產超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌耐藥性及基因型研究[J].中國抗生素雜志，2009，34（8）：512-515.

編輯/申磊