238散發(fā)性結(jié)直腸癌錯配修復蛋白的表達分析及其臨床意義

摘要：目的 分析錯配修復蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2在結(jié)直腸癌中的表達規(guī)律及臨床意義。方法 選取2009年1月～2013年10月經(jīng)病理學確診的散發(fā)性結(jié)直腸癌手術切除標本238例，所有患者在術前均未接受過放療或化療。免疫組織化學（Envision法）檢測MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白表達情況。結(jié)果 散發(fā)性結(jié)直腸癌組織中錯配修復蛋白的缺失率16.8%（40/238），與腫瘤的分化、發(fā)病年齡、性別方面均無相關性（r值均在-0.1～0.1）。MSH2與MSH6蛋白缺失有相關性（r=0.71），MLH1和PMS2蛋白的缺失率有相關性（r=0.70），MLH1與MSH2、MSH6蛋白缺失無相關性（r=-0.03、r=-0.01），PMS2與MSH2、MSH6蛋白缺失無相關性（r=-0.008、r=-0.02）。錯配修復蛋白缺失組與無缺失組在腫瘤的分化、發(fā)病年齡、性別方面均無差異性（P>0.05）。結(jié)論 在散發(fā)性結(jié)直腸癌組織中錯配修復蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2缺失與腫瘤的分化、發(fā)病年齡、性別方面均無相關性。MSH2與MSH6蛋白缺失有相關性，MLH1和PMS2蛋白的缺失率有相關性。

關鍵詞：散發(fā)性結(jié)直腸癌；錯配修復蛋白；免疫組織化學

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。其發(fā)生發(fā)展涉及到一系列遺傳學改變。已有大量的研究證實，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）存在于遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌（HNPCC），部分散發(fā)性結(jié)直腸癌（SCRC）胃癌等當中，MSI是錯配修復基因的異常造成的。錯配修復系統(tǒng)是遺傳不穩(wěn)定性的守護者，具有識別和修復DNA合成期間的錯配堿基的功能[1]。通常由錯配修復基因 MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2 編碼的錯配修復蛋白修正這類錯誤[2]。有研究報道，細胞系中錯配修復蛋白缺陷與化療劑的抵制有相關性。MSI陽性腫瘤的預后和化療敏感性與MSI陰性病例不同，通過檢測表型為治療和預后提供依據(jù)[3]。

1資料與方法

1.1一般資料 選取2009年1月～2013年10月經(jīng)病理學確診的散發(fā)性結(jié)直腸癌手術切除標本238例，所有患者在術前均未接受過放療或化療。其中男性125例，女性113例；年齡26～85歲，平均年齡（64.7±12.0）歲，中位年齡66歲；高分化腺癌7例，中分化腺癌197例，低分化腺癌34例。

1.2方法 鼠抗人MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2的單克隆抗體及免疫組織化學染色Envision法試劑盒為Dako公司產(chǎn)品。購自福州邁新生物技術有限公司。

所有標本經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，貼于經(jīng)APES處理的載玻片上，分別進行HE染色和免疫組織化學染色。用已知陽性標本切片做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照。

1.3結(jié)果判定 每張切片選擇有代表性的區(qū)域，并避開切片周邊區(qū)域，光鏡下隨機觀察5個高倍鏡視野。參照Friedrichs等[4]免疫組化評判標準，染色深淺需與背景染色相對比，分別對染色強度進行計分。染色強度計分：無色為 0 分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。0分與<20%腫瘤細胞1 分為低表達，陰性。四個錯配修復蛋白任何一個缺失為MSI陽性。

1.4統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)分析均采用SPSS16.0軟件，錯配修復蛋白缺失與腫瘤的相關性及MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2之間的相關性分析采用PEARSON相關分析，絕對值在0.8～1.0極強相關，0.6～0.8強相關，0.4～0.6中等程度相關，0.2～0.4弱相關，0.0～0.2極弱相關或無相關。

2結(jié)果

2.1散發(fā)性結(jié)直腸癌組織中錯配修復蛋白的缺失率為16.8%（40/238），與腫瘤的分化、發(fā)病年齡、性別方面均無相關性（r值均在-0.1～0.1）。在Envision法做的免疫組化染色中，MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白主要在上皮細胞核中表達，部分胞質(zhì)僅有弱陽性，不作為陽性判斷，間質(zhì)細胞核有陽性表達可作為陽性對照。正常結(jié)直腸組織均有 MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白胞核表達，染色深呈棕褐色。只要一個蛋白表達缺失即認為錯配修復蛋白功能缺陷。在238例中共有40例伴有1種到3中錯配修復蛋白缺失，總?cè)笔试?6.8%（40/238）。有錯配修復蛋白缺失的病例與發(fā)病年齡的相關系數(shù)r=0.012，與腫瘤的分化的相關系數(shù)r=0.013，均沒有相關性。

2.2 MSH2與MSH6蛋白缺失有相關性，MLH1和PMS2蛋白的缺失率有相關性。在238例結(jié)直腸癌組織中，13例 MLH1蛋白表達缺失，其中伴有11例PMS2蛋白同時表達缺失，MLH1和PMS2蛋白的缺失率有相關系數(shù)r=0.70。15 例MSH2 表達缺失，其中有13例同時伴有MSH6蛋白表達缺失，MSH2與MSH6蛋白缺失有相關性（r=0.71）。MLH1與MSH2、MSH6蛋白缺失無相關性（r=-0.03、r=-0.01），PMS2與MSH2、MSH6蛋白缺失無相關性（r=-0.008、r=-0.02）。

2.3錯配修復蛋白缺失組與無缺失組在發(fā)病年齡、性別及腫瘤的分化方面均無差異性。在238例結(jié)直腸癌中，女性113例，占47.5%，男性125例，占52.5%。在錯配修復蛋白缺失組，女性19例，占47.5%，男性患者21例，占52.5，與總體性別比例完全一致，兩者無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。由于錯配修復蛋白缺失組中，高分化腫瘤之占4例，病例數(shù)較少，不宜做χ2檢驗，但是腫瘤的分化的相關系數(shù)r=0.013，可以判定錯配修復蛋白缺失與腫瘤分化沒有相關性，見表1。

3討論

近年的研究發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）為結(jié)直腸癌發(fā)病的另一重要機制，是遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（hereditary non-polyposis colorectal cancer HNPCC）及部分散發(fā)性結(jié)直腸癌發(fā)生的重要原因。目前關于微衛(wèi)星不穩(wěn)定的研究不僅僅局限于發(fā)病機制上，其與結(jié)直腸癌預后的關系也密切相關。錯配修復基因功能異常使其不能產(chǎn)生正常的具有糾正錯配功能的缺陷性蛋白質(zhì)，而導致微衛(wèi)星不穩(wěn)定。散發(fā)性MSI結(jié)直腸癌常由于MMR基因的甲基化導致錯配修復蛋白不表達從而使DNA復制錯誤增加、微衛(wèi)星不穩(wěn)定而使腫瘤發(fā)生。由于MLH1、PMS2、MSH2、MSH6表達的減少預示著腫瘤細胞處于微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)[5]，對這四項指標進行檢測，對微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的檢測的吻合率達99%。

從已經(jīng)發(fā)表的數(shù)據(jù)來看，各個研究小組間對錯配修復蛋白的缺失率、與腫瘤的分化、發(fā)病年齡、以及不同蛋白間的不同相關性的研究結(jié)果不盡一致。通過本實驗的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析來看，散發(fā)性結(jié)直腸癌組織中錯配修復蛋白的缺失率為16.8%（40/238），與腫瘤的分化、發(fā)病年齡、性別方面均無相關性（r值均在-0.1～0.1）。

人類錯配修復系統(tǒng)對堿基的識別遵守甲基導向機制，也是利用DNA兩條鏈甲基化狀態(tài)的差異，識別含錯配的子鏈。人類MMR作用的機理是；首先MSH2與MSH6形成的MUTS-A二聚體，在由MLH1和PMS2形成的二聚體MUTL-A協(xié)助下，特異性地識別并修復單個錯配，插入或缺失的堿基。HMUTS-B（HMSH2/HMSH3蛋白二聚體）在MUTL-A及MUTL-B（MLH1/PMS1蛋白二聚體）協(xié)助下，特異性識別并修復較大片斷的插入或缺失[6]。而在某些研究小組的資料卻顯示MLH1與MSH2具有相關性。通過本實驗的舒服分析可以看出，MSH2與MSH6蛋白缺失有相關性，MLH1和PMS2蛋白的缺失率有相關性。MLH1與MSH2、MSH6蛋白缺失無相關性（r=-0.03、r=-0.01）。

目前我國結(jié)直腸癌的發(fā)生率呈上升趨勢，而MSI+結(jié)直腸癌的特征對篩選具有遺傳性非息肉病行結(jié)直腸癌，以及對化療藥物的選擇性應用有著顯著的應用價值，都對臨床治療有重要指導意義。錯配修復蛋白的檢測可以很好的反應微衛(wèi)星不穩(wěn)定，其與結(jié)直腸癌的發(fā)生、治療、預后的相關研究有待進一步的深入。

參考文獻：

[1]玄之玄，林國樂，于新明，等.hMLH1 在直腸上皮內(nèi)瘤變和早期直腸癌組織中表達[J].中會胃腸外科雜志，2012，15（11）：1162-1165.

[2]Buermeyer AB，Deschenes SM，Baker SM，et al. Mammalian DNA mismatch repair[J].Annu Rev Genet，1999，33：533-564.

[3]馬恒太.錯配修復基因異常改變與大腸癌的關系[J].實用癌癥雜志，2004，19（2）：203-204.

[4]Friedrichs K，Gluba S，Eidtmann H，et al.Over expression of p53 and prognosis in breast cancer[J].Cancer，1993，72（12）：3641-3647.

[5]Bueyeros AB，Denseness SM，Baker SM，et al.Mammalian DNA mismatch repair[J].Ainu Rev Genet，1999，33：533-564.編輯/張燕