硫辛酸對糖尿病腎病大鼠的AGEs及氧化應激影響的實驗研究

摘要：目的 探討硫辛酸對DN大鼠AGEs及氧化應激影響。方法 30只Wistar大鼠隨機取6只作正常對照組，余鏈脲佐菌素（STZ）2次腹腔注射造模，糖尿病腎病大鼠按血糖水平隨機分為糖尿病腎病組（B組）和LA組（C組），分別給予生理鹽水和LA（50 mg/Kg/d）1 mL腹腔注射4 w。測定各組體重、隨機血糖、24 h尿白蛋白、FPG、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、HDL-C、LDL-C、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗凝血糖化血紅蛋白（GHbA1c）、血清晚期糖基化終末產物（AGEs）、腎臟RAGE基因表達。結果 糖尿病腎病組及LA組TG、TC、HDL-C、LDL-C、GHbA1c、AGEs、MDA、水平顯著高于正常對照組；與B組比較，C組MDA下降，血SOD、GSH-Px均增加，SOD的差異有顯著性；C組和B組均檢測到腎臟組織RAGE的表達，正常對照組未檢測到RAGE表達。結論 DN時循環和腎組織局部AGEs含量增高，RAGE表達上調，LA可通過減少氧化應激而抑制AGEs生成及下調RAGE表達，進而改善DN大鼠腎組織結構和腎功能。

關鍵詞：氧化應激；AGEs；RAGE；糖尿病大鼠；糖尿病腎病

糖尿病腎病是嚴重的糖尿病微血管并發癥之一，高血糖引起自由基蓄積，氧化應激水平升高[1]，導致腎臟組織損傷，推動DN的發生發展。本研究主要目的是利用長期高糖高脂飲食聯合小劑量鏈脲佐菌素，制備2型糖尿病腎病大鼠模型，探討硫辛酸對糖尿病腎病大鼠的AGEs及氧化應激的影響，并觀察腎臟RAGE的表達情況。

1資料與方法

1.1主要試驗儀器與藥品 血糖儀及相應試紙（Biosen C-line Diagnostic），HITACHI 7180生化分析儀（日本日立公司），高速冷凍離心機GL-20G-Ⅱ（上海安亭科學儀器廠），MDF-382E型Ultra-low Temperature Freezer（日本SANYO電子化學有限公司）， RF5301PC型紫外熒光分光光度計（日本島津）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）：購自Sigma Chemical Co，USA，魚精蛋白鋅長效胰島素注射液：10 mL：400單位，江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司。

1.2實驗動物 30只健康雌性Wistar大鼠，3個月齡，均重（276.36±7.79）g，購自山東大學實驗動物中心，合格證號：SCXR（魯）20030004，室溫（22±2）℃，12 h（8∶00～20∶00）光照交替，自由攝入標準固體顆粒飼料（含1.13%鈣、0.66%磷，山東大學動物實驗中心提供）和自來水。

1.3方法 實驗前大鼠適應性喂養1 w，隨機取6只作正常對照組（A組），喂以普通飼料。余24只大鼠作糖尿病造模組，高糖高脂飼料喂養8 w（不限每日熱量），禁食12 h后左下腹腔注射STZ （30 mg/Kg，1次/2 w，共2次），正常對照組注射等量檸檬酸鹽緩沖液。末次STZ注射1 w后糖尿病造模組行腹腔內葡萄糖耐量試驗（大鼠禁食6～8 h，按2 g/Kg體重腹腔注射30%葡萄糖溶液，尾靜脈采血測血糖，以FPG≥7.0 mmol/L，或糖負荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L者為糖尿病造模成功鼠）。持續觀察8 w，以隨機血糖≥16.0 mmol/L伴胰島素敏感性下降，并出現微量白蛋白尿為糖尿病腎病造模成功鼠，并按血糖水平隨機分為糖尿病腎病組（B組）和LA組（C組），分別給予生理鹽水和LA（50 mg/Kg/d） 1 mL腹腔注射4 w，每周按體重調整各組注射劑量。

1.4標本收集與檢測 所有動物收集24 h尿。處死前禁食16 h并稱重。心室取血處死大鼠，血液靜置2 h后，3000 rpm離心10min，分離血清，-20℃保存備作生化標志物及有關氧化應激指標測定；仰臥位固定大鼠，沿腹正中線逐層打開腹腔，切取右腎，去掉被膜，冰凍保存于-80℃液氮中，用于提取腎臟RNA。

1.5統計學處理 統計分析數據以（x±s）表示，應用統計學軟件SPSS19.0 處理。組間均數比較采用獨立樣本t檢驗（independent sample t test）。差異顯著性水平為雙尾0.05。相關性采用Pearson相關分析。

2結果

2.1三組大鼠血AGEs、胰島素及胰島素抵抗等的變化 與A組比較，B組和C組大鼠血AGEs、HbA1c、FPG、FINS升高，差異有顯著性（P<0.05或P<0.01）；與B組大鼠比較，C組大鼠血AGEs、HbA1c、FPG、FINS下降（P<0.05），見表1。

2.2三組大鼠血脂、24 h尿蛋白水平的變化 與A組比較，B組大鼠血TC、TG、LDL-C、24 h尿蛋白均升高，差異有顯著性（P<0.05或P<0.01），說明存在脂代謝紊亂及腎損害；與B組大鼠比較，C組大鼠血TC、TG、LDL-C、24h尿蛋白下降（P<0.05）；三組大鼠HDL-C無明顯變化，見表2。

2.3三組大鼠氧化應激指標的變化 與A組比較，B組大鼠血MDA升高，差異有顯著性（P<0.05），而SOD、GSH-Px均下降，與B組比較，C組血MDA下降，血SOD、GSH-Px均增加，但GSH-Px差異無顯著性，見表3。

2.4三組大鼠腎臟RAGE的RT-PCR結果 腎組織總RNA OD260/OD280均1.7～2.0，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳示28S與18S的光密度比值約為2。LA組和糖尿病腎病組均檢測到腎臟組織RAGE的表達，正常對照組未檢測到RAGE表達。

2.5相關性分析 LA組大鼠MDA水平與FINS、IAI、TC、TG、LDLC呈顯著正相關，SOD水平與FINS、IAI、TC、TG、LDLC呈顯著負相關；LA組大鼠AGEs與MDA、24 h尿蛋白呈顯著正相關，而與SOD、GSH-Px呈顯著負相關。

3討論

實驗顯示，糖尿病造模成功組與正常對照組相比，FINS、IRI、TC、TG、LDLC等明顯升高（P<0.05）， 而與B組比較，C組治療4 w后上述指標顯著下降（P<0.05）。證實硫辛酸可改善2型糖尿病糖脂代謝，且LA組大鼠的MDA水平與FINS、IRI、TC、TG、LDLC呈顯著正相關，SOD水平與之呈顯著負相關，可能與LA通過增強胰島素受體激酶、胰島素受體基質-1、磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B等活性，介導葡萄糖轉運載體GLUTl和GLUT4向胞膜易位，增強葡萄糖的代謝有關[2]。高脂血癥在2型糖尿病的腎損傷中起重要作用，有研究表明高膽固醇血癥可誘發或加重腎小球硬化和小管間質損傷[3]。胰島素抵抗與腎臟的哪些病理改變有關目前仍不清楚，但它在2型糖尿病腎損傷的發生發展中發揮一定作用[4]，而LA可增加血中脂蛋白酯酶（LPL）、肝酯酶（HL）活性[5]并穩定血脂水平，與本實驗研究一致。

氧化應激通過直接損傷足細胞、改變腎小球血管通透性、增強炎癥反應等諸多途徑參與糖尿病腎病發生、發展[6]，本實驗顯示與B組比較，C組血MDA下降，SOD、GSH-Px均增加，24 h尿蛋白減少，證實LA可明顯改善糖尿病大鼠氧化應激水平并降低尿蛋白排泄，對腎臟有一定保護作用。有研究表明AGEs在腎臟組織積聚是導致糖尿病腎病的重要因素[6]，本實驗檢測到糖尿病腎病組大鼠的GHb水平明顯升高（P<0.01），AGEs熒光值明顯降低（P<0.01），也證實糖尿病腎病大鼠腎組織內非酶糖基化作用增強。AGEs具有多種受體，目前研究較多的RAGE在糖尿病動物模型中視網膜、系膜細胞和主動脈上均有高水平表達，并促進腎小球硬化，本實驗LA組和糖尿病腎病組均檢測到腎臟組織RAGE表達，對照組未檢測到。硫辛酸治療后，血AGEs、MDA水平較腎病組明顯下降（P<0.05），SOD有所增加，且AGEs與MDA、24 h尿蛋白呈顯著正相關，而與SOD、GSH-Px呈顯著負相關，說明DN時ROS產生增加，自由基清除能力下降，使用LA有降低糖尿病腎病大鼠晚期糖基化作用，降低循環和腎組織局部的AGEs含量，抑制氧化應激反應，并減少RAGE mRNA和蛋白在腎臟組織表達水平，進而發揮腎保護作用，在DN的防治中有良好的應用前景。

綜上所述，本研究證實硫辛酸可以通過減少氧化應激而抑制AGEs生成及下調RAGE表達，降低尿蛋白，進而減緩糖尿病腎病的發生發展。

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編輯/張燕