過表達CCR3的人胃癌細胞株的建立

摘要：目的 建立過表達CCR3人SGC7901胃癌細胞細胞株，為后續CCR3在胃癌轉移的研究奠定基礎。方法 分離正常人外周血單個核細胞，提取總RNA，PCR擴增CCR3基因CDS序列，連接至質粒pEFP-N1，進行CCR3基因的克隆，構建含有CCR3基因的pEFP-N1-CCR3重組質粒。重組質粒通過脂質體轉染法對人SGC7901胃癌細胞進行轉染。結果 Realtime-PCR及Westernblot證實CCR3基因能夠在人SGC7901胃癌細胞中正確表達。結論 成功建立穩定表達CCR3基因的SGC7901胃癌細胞株，為研究CCR3在胃癌細胞株轉移中的機制奠定了基礎。

關鍵詞：CCR3；SGC7901細胞；胃癌轉移

趨化因子受體（Chemokine receptor）是表達在一些特定的細胞表面的G蛋白偶連的七跨膜域受體[1]。這些受體與細胞外的配體趨化因子結合。與特異的趨化因子結合后，趨化因子受體引發鈣離子內流而產生細胞趨化反應，從而誘導細胞到生物體的特定部位。CCR3在胃癌遠端遷移上到底扮演什么樣的角色也未完全清楚。目前， 將外源性CCR3基因轉入人胃癌細胞使其過度表達未見報道。本實驗嘗試構建含有CCR3的重組質粒pEFP-N1-CCR3并轉染至人SGC7901胃癌細胞，并檢測轉染后SGC7901細胞CCR3的表達情況。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1質粒菌株和慢病毒包裝細胞pEFP-N1慢病毒穿梭載體，psPAX2和pMD2G包裝質粒，大腸桿菌DH5。人SGC7901胃癌細胞，生長培養基為高糖DMEM培養基，含10%胎牛血清。

1.1.2 主要試劑及引物 Lipofectine2000轉染試劑盒；T4連接酶；質粒抽提試劑盒；限制性內切酶EcoRI和BamHI；胎牛血清；CCR3一抗；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG。

1.2人SGC7901胃癌細胞的培養 人SGC7901胃癌細胞常規培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖的完全培養基中，置于37℃，5%CO2孵育箱中貼壁培養，0.25%胰酶3d傳代換液一次。

1.3 pEFP-N1-CCR3的構建及鑒定

1.3.1 CCR3的CDS序列擴增 取健康人外周血，淋巴細胞分離液分離單個核細胞并抽提總總RNA，在Pubmed中的nucleotide上查詢CCR3的CDS編碼區并設計克隆引物， 并在克隆引物中加入BglII和EcoRI酶切位點， 用taq聚合酶擴增CCR3的CDS序列，

1.3.2 重組載體構建和鑒定 將PCR反應電泳回收產物和pEFP-N1質粒用限制性內切酶BglII和EcoRI 37℃雙酶切1h。取5uL酶切好的PCR片段與5uL酶切好的質粒DNA反應液混合并加入T4連接酶及其連接酶緩沖液， 4℃連接過夜。將連接產物加入DH5感受態細胞， 將轉化的DH5感受態細胞涂抹到含100μg/ml Kana 抗性的LB固體培養基上，放置室溫至液體吸收，并在37℃培養箱中培養過夜。次日挑取單克隆菌落并加入含100μg/ml Kana 抗性的LB液體培養基上搖菌過夜， 抽提LB液體培養基中的重組質粒，并用BglII和EcoRI限制性內切酶雙酶切后行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測， 陽性菌落送上海生工生物公司進行測序分析，以鑒定pEFP-N1-CCR3質粒中是否正確插入CCR3的CDS片段。

1.4轉染CCR3的SGC7901細胞中CCR3表達的檢測

1.4.1 Real-Time PCR檢測CCR3mRNA表達 根據GenBank的人CCR3基因序列， 設計熒光定量PCR引物并合成。上游引物序列：5′TGGCATGTGTAAGCTCCTCTC 3′，下游引物序列：5′ CCTGTCGATTGTCAGCAGGATTA 3′，設計并合成內參照β-actin引物， 上游引物序列：5′CTCCATCCTGGCCTCGCTGT3′，下游引物序列：5′GCTGTCACCTTCACCGTTCC 3′。在lipofection瞬時轉染4d后提取細胞總RNA， 逆轉錄后進行real-time PCR。反應條件：95℃維持10min； 95℃ 15 s、60℃ 50 s；共35個循環。各組mRNA同內參基因相比得到相對表達量。

1.4.2 Western blotting檢測CCR3蛋白表達 lipofection轉染4d后，用細胞裂解液裂解細胞提取蛋白。用蛋白濃度測定試劑盒調整各組蛋白濃度后并加入蛋白上樣緩沖液，95℃變性5 min再進行PAGE蛋白電泳。將轉移蛋白的PVDF膜用脫脂奶粉封閉0.5h，分別加入CCR3和β-actin一抗4℃孵育過夜。次日用1×TBST洗膜3次，5min/次，充分洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的IgG二抗，室溫孵育0.5h，用1×TBST洗膜3次，最后加入定影液和顯影液，在Bio-Rad成像儀上顯影。

2 結果

2.1 CCR3基因的提取與鑒定 根據GenBank的CCR3基因編碼區（CDS）設計相應引物， PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，可見1067bp的特異條帶， 與GenBank一致。

2.2 重組pEFP-N1-CCR3質粒的篩選和鑒定 挑取LB固體培養基陽性克隆菌搖菌并抽提質粒進行測序，發現與GenBank中CCR3基因序列比對完全正確，無任何堿基突變。

2.3 Real Time PCR檢測mRNA結果 CCR3-人SGC7901胃癌細胞組CCR3mRNA表達量明顯高于GFP-人SGC7901胃癌細胞組，差異有統計學意義（P=0.0084）。

2.4 Western blotting檢測蛋白表達 兩組均在約55kDa（CCR3）、42kDa （β-actin）處見到特異性條帶，發現 CCR3-SGC7901組條帶顏色相比GFP-SGC7901組顏色明顯較深（圖6）。經過分析，顯示CCR3-SGC7901組轉染的細胞中CCR3蛋白表達量明顯升高，表明CCR3可以正確在SGC7901細胞中表達。

3 討論

通過慢病毒pEFP-N1穿梭載體， 將CCR3和GFP基因融合表達在一起， 這將有利于轉染后對目標細胞進行示蹤研究，達到GFP和CCR3的融合表達。為了驗證所構建重組質粒pEFP-N1-CCR3的活性，本實驗成功構建了人CCR3和GFP基因融合表達的重組質粒pEFP-N1-CCR3， 具有良好的表達活性，并且能夠在人SGC7901胃癌細胞正確表達。

編輯/王海靜