模擬胃液條件下假蒟葉提取物抑制亞硝化反應的研究

摘要[目的] 研究不同溶劑的假蒟葉提取物對亞硝化反應的影響。[方法] 在模擬胃液條件下，測定假蒟葉提取物亞硝酸鹽清除率及亞硝胺合成阻斷率。[結果] 不同溶劑的假蒟提取物均有一定的抑制亞硝化反應作用，其中乙酸乙酯提取物的抑制作用最強，且其對亞硝酸鹽的清除率及對亞硝胺合成的阻斷率在一定的濃度范圍內隨其濃度的增加而增加，對亞硝酸鹽清除能力較強，其IC50值為0.425 mg/ml，對亞硝胺合成阻斷的能力相對較低，其IC50值為4.064 mg/ml。[結論] 假蒟葉提取物具有較好的亞硝化反應抑制活性且主要通過清除底物亞硝酸鹽來實現。

關鍵詞 假蒟葉；提取物；清除亞硝酸鹽；亞硝胺合成阻斷

中圖分類號S601.9文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）29-10326-02

基金項目國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201310566007）；農產品加工省部共建國家重點實驗室培育基地、農業部功能食品重點實驗室開放基金項目（201306）。

作者簡介周斯儀（1992-），女，廣東汕尾人，本科生，專業：食品科學與工程。*通訊作者，講師，博士，從事食品功能因子及功效評價方面的研究。

亞硝酸鹽廣泛存在于土壤、水和動植物體內，也可由硝酸鹽轉化而來，還可作為發色劑和抑菌劑廣泛應用于食品加工。亞硝酸鹽對人體具有一定的危害性，不僅能將血紅蛋白中的二價鐵氧化成三價鐵，導致高鐵血紅蛋白血癥[1]；而且在酸性條件下，亞硝酸根可與食品或人體內的胺類發生亞硝化反應，生成N亞硝胺類化合物。亞硝胺進入人體后，主要經過肝微粒體內細胞色素P450酶的代謝活化，生成烷基偶氮羥基化合物，此類代謝產物具有很強的致癌和致突變活性[2]。亞硝胺是目前所知的最強的化學致癌物質之一，它能引起人和動物胃、肝臟等多種臟器的惡性腫瘤[3]。除了通過直接攝入外，亞硝胺在人體胃腸道的酸性環境中，特別是胃液中更適于合成亞硝胺[4]，雖然正常情況下不會對身體造成危害，但如果攝入過多亞硝酸鹽，體內產生過多的亞硝胺，會增加誘發癌癥的風險。因此，清除亞硝胺生成前體物或阻斷亞硝胺在體內的合成，是防癌抗癌的有效途徑之一，篩選出對亞硝化反應具有抑制作用的植物成分是一項具有積極意義的課題。

假蒟（Piper sarmentosum Roxb.）是胡椒科胡椒屬植物，廣泛分布在我國東南沿海地區和東南亞國家，是當地廣為使用的調味品和藥用植物。前人研究提示，假蒟富含多種活性成分，具有抗氧化、抑菌、抑癌等作用[5-9]，但假蒟提取物對亞硝化反應的影響未見報道。筆者通過模擬人體胃液條件下，不同極性溶劑的假蒟提取物對清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成的作用，并篩選出了具有良好作用效果的組分，以期為假蒟的進一步開發利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料假蒟葉：2013年12月，采摘于廣東省湛江市湖光巖，洗凈后陰干備用。主要試劑：胃蛋白酶（酶活600～1 000 U/mg），北京鼎國昌盛生物；石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、60%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、鹽酸、氯化鈉、亞硝酸鈉、碳酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、α萘胺、二甲胺等試劑，均為分析純。主要儀器設備：KQ500DB數控超聲波清洗器，N1000DW旋轉蒸發儀，CR22GⅢ冷凍干燥機，WD-9403C紫外儀，UV3200PC可見紫外分光光度計，HH.S216數顯水浴鍋，AUW120電子天平。

1.2方法

1.2.1假蒟浸提物的制備。陰干后的假蒟葉粉碎至80目，分別用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、60%乙醇、95%乙醇、無水乙醇和水按1∶20 g/ml的料液比配置，并用400 W超聲波助提30 min后，在45 ℃水浴浸提4 h，然后經抽濾、減壓旋轉濃縮和真空干燥，即得不同溶劑提取物。

1.2.2模擬胃液的制備。稱取2.0 g NaCl加去離子水溶解，加入7 ml濃HCl，加6.0 g的胃蛋白酶，加去離子水定容至1 000 ml。

1.2.3亞硝酸鈉標準溶液的配制。準確稱取0.100 0 g于硅膠干燥器中干燥24 h，加水溶解移入500 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，亞硝酸鈉儲備液（200 μg/ml），避光保存備用。臨用前，吸取亞硝酸鈉標準溶液5.00 ml，置于200 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得亞硝酸鈉標準使用液A（5.0 μg/ml）；吸取亞硝酸鈉標準溶液69.00 ml，置于200 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，即得亞硝酸鈉標準使用液B（1.0 mmol/L）。

1.2.4亞硝酸鹽清除率的測定。采用鹽酸萘乙二胺法[10]，在弱酸條件下，亞硝酸鈉與對氨基苯磺酸發生重氮化后，與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，用分光光度計測出吸光率，經計算即可得出提取物在模擬胃酸條件下對亞硝酸鹽的清除率。

取25 ml比色管，加入10 ml模擬胃液于37 ℃水浴10 min取出，再加入1 ml的假蒟葉提取物和2 ml的5.0 μg/ml亞硝酸鈉，在37 ℃水浴1 h，取出，立即加入4 g/L對氨基苯磺酸溶液2 ml ，混勻，靜置4 min后各加入2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液1 ml，加去離子水至刻度，混勻，靜置 20 min，用2 cm比色杯于波長538 nm處測吸光度A1。

空白對照組：以去離子水代替亞硝酸鈉標液的空白對照試驗測得吸光度A01；以去離子水代替假蒟葉提取物溶液的空白對照試驗測得吸光度A02。

亞硝酸鹽清除率（%）=[（ A01+A02-A1）/A02]×100%

式中，A1，加假蒟葉提取液的測定值；A01，去離子水代替亞硝酸鈉標液的空白對照組的測定值；A02，以去離子水代替假蒟葉提取物溶液的空白對照組的測定值。

1.2.5亞硝酸胺合成阻斷率測定。采用α萘胺法[11-12]。在模擬胃液條件下，亞硝酸鈉與二甲胺生成二甲基亞硝胺。紫外光照下，二甲基亞硝胺可分解成甲基仲胺和亞硝酸根，亞硝酸根與對氨基苯磺酸發生重氮化反應后，再與α萘胺耦合生成紅色化合物，用分光光度計測出吸光度值，經計算即可得出模擬胃液條件下樣品對亞硝胺合成的阻斷率。

取5支25 ml比色管中加入模擬胃液10 ml，分別加入1 ml的樣品或對照組，再加入濃度1 mmol/L的二甲胺溶液1 ml，1 mmol/L的NaNO2溶液1 ml，用蒸餾水稀釋至刻度，在37 ℃恒溫水浴1 h。用移液管吸取2 ml上述溶液加到試管和培養皿，加入質量分數0.5%Na2CO3溶液1 ml，于紫外分析儀（波長254 nm）上斜放照射15 min。取出后加入質量分數1%對氨基苯磺酸3 ml，搖勻后靜置3～5 min，再加入α萘胺3 ml，搖勻靜置20 min，在波長538 nm下測定吸光度A2。以去離子水代替亞硝酸鈉標液的空白對照試驗，測得吸光度A03；以去離子水代替假蒟葉粗提取液的空白對照試驗測得吸光度A04。

亞硝胺合成的阻斷率（%）=[（A03+A04-A2）/A04]×100%

式中，A2，加假蒟葉提取物的測定值；A03，去離子水代替亞硝酸鈉標液的空白對照組的測定值；A04，以去離子水代替假蒟葉提取物溶液的空白對照組的測定值。

2結果與分析

2.1不同溶劑的假蒟葉提取物對亞硝酸鹽清除率的影響由圖1可以看出，在模擬胃液條件下，8種不同溶劑的假蒟葉提取物對亞硝酸鹽均有一定的清除作用，其對亞硝酸鹽的清除活性強弱依次為：乙酸乙酯>無水乙醇>石油醚>60%乙醇>95%乙醇>氯仿>正丁醇>水。其中乙酸乙酯提取物（0.05%）清除亞硝酸鹽的能力最強，高達99.187%，與同濃度的陽性對照VC對亞硝酸鹽的清除率相當，其他各提取物清除亞硝酸鹽的能力明顯弱于VC，水提取物的清除率最低。

圖1不同溶劑的假蒟葉提取物對亞硝酸鈉清除率的比較2.2不同溶劑的假蒟葉提取物對亞硝胺合成阻斷率的影響由圖2可以看出，在模擬胃液條件下，8種不同溶劑的假蒟提取物對亞硝胺合成均有一定的阻斷作用，其對亞硝胺合成阻斷活性強弱依次為：95%乙醇>乙酸乙酯>60%乙醇>無水乙醇>正丁醇>石油醚>氯仿>水。其中95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物（0.05%）對亞硝胺合成阻斷的能力最強，高于43.842%，接近同濃度的陽性對照VC的作用，其他各提取物阻斷亞硝胺合成的能力明顯弱于VC，水提取物的阻斷率較低。綜合分析不同提取物對亞硝酸鹽清除能力和亞硝胺合成阻斷率的影響，乙酸乙酯提取物對亞硝化反應的抑制能力最強，因此對其作進一步的量效分析。