*EGCG對惡性膠質(zhì)瘤細胞凋亡的實驗研究

摘要： 目的：研究探討EGCG對惡性膠質(zhì)瘤細胞凋亡過程的影響作用，探討EGCG抗惡性膠質(zhì)瘤細胞的可能機制。方法：MTT法檢測EGCG處理惡性膠質(zhì)瘤細胞后的活性及流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。結(jié)果：與對照組相比，隨著用藥濃度增高，細胞生長抑制率逐漸增高，即細胞活性下降（P<0.05）。結(jié)論： EGCG抗惡性膠質(zhì)瘤細胞的可能機制發(fā)生細胞凋亡，為抗惡性膠質(zhì)瘤治療方面的臨床用藥奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：EGCG；惡性膠質(zhì)瘤；細胞凋亡。

多形性膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性神經(jīng)上皮細胞腫瘤，占膠質(zhì)瘤的25%以上，也是100種腦癌類型中最兇險的惡性腦癌[1]。手術(shù)切除后常很快復(fù)發(fā)，預(yù)后極差，盡管實行傳統(tǒng)手術(shù)，化學(xué)治療及輻射治療，但患者多在2年內(nèi)死亡[2]。，故在治療上是一個世界性難題。近年來，植物來源藥物越來越受到重視，充分利用我國藥用植物資源，開發(fā)新的抗腫瘤藥物，已成為腫瘤研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容。現(xiàn)代研究表明， 茶多酚具有抗腫瘤，抗氧化，抗炎效應(yīng)。同時也能抑制多種細胞黏附分子、TNF、COX-2和MMP-9的表達[3]。因此， 表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是一類非常有前途的抗腫瘤藥物[2]。本實驗我們進行了EGCG誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細胞凋亡的研究，現(xiàn)報告如下：

【中圖分類號】R651 【文獻標識碼】B 【文章編號】1672-8602（2014）06-0003-02

1 材料與方法

1. 1 材料 高糖型DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；新生小牛血清購自杭州四季青公司；DMSO、MTT均為Sigma公司產(chǎn)品。處理細胞時，DMSO的最終體積小于或等于0.1%。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取惡性膠質(zhì)瘤細胞U87MG傳代30～36h處于對數(shù)生長期的細胞（約70%～80%融合），以每孔0.5×105細胞平均接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔體積1ml，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁供實驗用。

1.2.2 與EGCG共孵育 去除含原培養(yǎng)液，用不含血清的培養(yǎng)液洗3次后，加入等量的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，同時按實驗要求加入不同濃度（0.1、10、15、20μM）的EGCG，另每孔加100ng/ml 的PMA。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)48h后，收集細胞和上清液。

1.2.3 MTT 法 細胞種植于24孔培養(yǎng)板，生長至80%融合，EGCG濃度梯度組（5%、10%、15%）處理，24h后加入終濃度為0.5g/L的MTT溶液，繼續(xù)37℃孵育4h；酶標儀測定在570nm波長處吸光度值。用以下公式計算細胞生長抑制率。抑制率（%）=100%×（對照組吸光度值均值-實驗組吸光度值均值）/對照組吸光度值均值。

1.2.4 流式細胞儀分析 繼續(xù)孵育24h后，收獲細胞，制成單細胞懸液，700g離心5min，棄上清，冷PBS洗滌后，用-20℃預(yù)冷的70%乙醇于4℃固定24h。分析前調(diào)整細胞濃度為106/mL，取1mL細胞懸液，用PBS洗三次，加入RNase于37℃作用30min，再加入PI染液37℃避光染色30min，即可進行流式分析[3]。

1.2.5 統(tǒng)計分析 結(jié)果以x±s表示，n為樣本數(shù)，用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件分析。P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

2 結(jié)果

2.1 MTT 法測定細胞活性變化

U87MG細胞株與EGCG共孵育24h 后，與對照組相比，隨著用藥濃度增高，細胞生長抑制率逐漸增高，即細胞活性下降（P<0.01），可見EGCG呈濃度依賴性抑制胃U87MG細胞株生長。見表1 。

2.2 流式細胞儀分析

如表2所示，U87MG細胞株與EGCG共孵育24h后，隨著用藥濃度增高，細胞凋亡率與對照組相比，顯著增加；細胞周期分析結(jié)果顯示，20μM EGCG處理U87MG細胞24h后，G2/M期細胞百分率比對照組升高了3倍。

3 討論

真核多細胞生物的細胞數(shù)目是通過細胞的增殖和死亡二者的平衡來維持的，而維持這種平衡的因素之一的“死亡”在很大程度上是通過凋亡來實現(xiàn)的。腫瘤實際上也是一種凋亡異常的疾病，本該發(fā)生凋亡的細胞未發(fā)生凋亡是腫瘤發(fā)生的機制之一[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)許多化學(xué)藥物和放射治療方法都是通過誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮其抗癌作用的[5]。常規(guī)的化學(xué)藥品治療費用昂貴且具有嚴重的毒副作用。為克服這些缺點和不足，許多學(xué)者正在積 極尋找開發(fā)中藥來源的新型抗癌藥物。

本實驗以MTT法檢測觀察EGCG對惡性膠質(zhì)瘤細胞U87MG細胞，結(jié)果表明，EGCG對惡性膠質(zhì)瘤細胞U87MG細胞有明顯抑制作用，不同濃度EGCG對惡性膠質(zhì)瘤細胞細胞增殖呈現(xiàn)出不同程度的抑制作用，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。

細胞周期的阻滯與細胞凋亡、分化關(guān)系密切。細胞周期能夠順利發(fā)生、發(fā)展和完成， 取決于重要控制點。隨著細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展，本研究中經(jīng)終濃度為20μMEGCG處理U87MG細胞24h后，G2/M期細胞百分率比對照組升高了3倍。

說明較高濃度EGCG可誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細胞U87MG細胞發(fā)生顯著的G2/M期阻滯

參考文獻

「1」 Glas M， Rath BH， Simon M，. et al. Residual tumor cells are unique cellular targets in glioblastoma.. Ann Neurol. 2010，68（2）：264-269..

「2」 Dang L， Jin S， Su SM. IDH mutations in glioma and acute myeloid leukemia.. Trends Mol Med. 2010，16（9）：387-397..

「3」 Enloe BM， Jay DG. Inhibition of Necl-5 （CD155/PVR） reduces glioblastoma dispersal and decreases MMP-2 expression and activity. J Neurooncol. 2010.

「4」 Raizer JJ， Grimm S， Chamberlain MC， et al. A phase 2 trial of single-agent bevacizumab given in an every-3-week schedule for patients with recurrent high-grade gliomas.. Cancer. 2010