肉桂醛與鹽酸小檗堿聯合氟康唑抗白念珠菌效果體外實驗分析

【摘要】目的：研究肉桂醛與鹽酸小檗堿單獨使用，以及聯合氟康唑抗白念球菌的作用影響與機制。方法：采取體外藥物敏感試驗方法，檢測肉桂醛與鹽酸小檗堿單獨使用以及聯合氟康唑對白念球菌的抗菌活性；凝膠分析軟件分析其藥物對白念球菌PLB1基因的mRNA表達影響【1】。結果：肉桂醛與鹽酸小檗堿單獨使用時，其對白念球菌具有明顯的抑制生長作用；聯合氯康唑作用時，均具有協同作用；藥物處理的白念球菌PLB1的mRNA表達水平有明顯差異，聯合使用時比單獨使用時其表達水平明顯降低。結論：肉桂醛、鹽酸小檗堿與氯康唑都具有明顯的抗白念球菌作用，當藥物聯合時，白念球菌的PLB1基因mRNA的相對表達量明顯低于藥物單獨使用

【關鍵詞】體外實驗；肉桂醛；鹽酸小檗堿；氯康唑；白念球菌

【中圖分類號】R-0 【文獻標識碼】B 【文章編號】1671-8801（2014）02-0332-02

近些年，隨著抗菌藥物和激素在臨床上的大量應用，真菌感染率持續升高，其中白念球菌是院內感染的主要致病菌之一【2】。氟康唑是目前國內治療白念球菌感染的常用藥物，由于在臨床上長期的應用，耐藥菌株不斷產生，白念球菌對氟康唑的耐藥問題日漸凸顯【3】。研究表明，中藥中大量結構新穎、藥理活性強的化合物，在抗真菌感染中具有一定優勢。目前，聯合應用抗菌藥物來避免耐藥性產生的減少藥物副作用是治療真菌感染的研究方向之一。本次研究將通過探討肉桂醛、鹽酸小檗堿和氯康唑單獨及聯合抗白念球菌的作用及機制，為臨床上應用中藥及中、西藥物聯合治療白念球菌感染提供初步試驗依據。

1 資料與方法

1.1 藥液配制

1.2 菌液配置

取-800C凍存的白念球菌ATCC10231菌種100μL菌液，滴于SDA培養基上，用涂玻棒，將菌液均勻鋪于培養基。370C恒溫培養箱內10min后，將培養皿倒置并繼續培養24h。連續畫線接種于新培養基上，370C培養24h。直徑>1mm的菌液（5個單菌落）置于生理鹽水中，用RP-MI1640培養基稀釋菌濃度：5×104CFU/mL。

1.3 3 種藥物的藥敏試驗

參照美國臨床與實驗標準協會的真菌藥物敏感性試驗方案的微量稀釋法步驟操作：將肉桂醛、鹽酸小檗堿、氯康唑分別用RP-MI1640培養基倍比稀釋。加入96孔板中，每孔100μL藥液+100μL含菌培養液。同時設立對照組。每次實驗，均設立一組質控菌。經370C培養48h，觀察結果。每組設3個復孔，試驗重復5次。

1.4 聯合藥敏試驗

采用棋盤微量稀釋法檢測，在96孔板上，將肉桂醛、鹽酸小檗堿、氟康唑藥物原液分別用RPMI1640培養基倍比稀釋，使肉桂醛、鹽酸小檗堿、氟康唑的終濃度為單用時測得該種菌株MIC值的1/8、1/4、1/2、1、2、4倍濃度。按照棋盤格法的設計方式，以縱、橫兩個方向。將不同濃度的兩種聯合藥物各50μL加入96孔板中，每孔再加入100μL配制好的菌懸液，分別混合后進行藥物聯合作用。同時設陽性對照孔及陰性對照孔，混勻。真菌培養步驟和藥理處理時間同上。

1.5 3種藥物的單獨及聯合對白念球菌PLB1mRNA表達水平的影響

試驗設對照組、試驗組，經370C培養6～8h后，按照RNApure Yeast Kit酵母RNA提取試劑盒操作方法，提取各組總RNA，測定總RNA濃度和純度，在紫外透射儀上觀察，并掃描凝膠，檢測總RNA的完整性，進行逆轉錄及PCR反應。采用凝膠分析軟件對電泳結果分析，得到內參TFF3、目的基因PLB1的灰度值，目的基因mRNA的相對表達量用目的基因與內參基因條帶的灰度值的比值來表示。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 藥物單獨及其聯合抗白念球菌藥敏實驗的結果

藥物單獨作用于白念球菌時：肉桂醛、鹽酸小檗堿、氯康唑抗白念球菌的MIC范圍分別為160～320、80～160和8～16μg/mL，其MIC80分別為：320、80、16μg/mL；藥物兩兩聯合作用于白念球菌時，單藥MIC值得幾何均數均顯著減少（見表1）。

表1 藥物聯合抗白念球菌作用效果評價

2.2 藥物對白念球菌相關PLB1基因mRNA表達的影響

通過RT-PCR技術，得到內參基因TEF3和PLB1擴增產物分別呈517bp和416bp條帶。其PLB1基因在mRNA的相對表達量水平。

3 討論

本研究通過肉桂醛、鹽酸小檗堿單獨及聯合氟康唑作用白念球菌，對白念球菌PLB1的表達水平進行分析，檢測結果顯示：肉桂醛、鹽酸小檗堿單獨抗菌時，均可降低白念球菌酶基因PLB1mRNA的表達量，引起細胞外PL的分泌量降低，當分別與氟康唑聯合時，其白念球菌酶基因PLB1mRNA的表達量要明顯低于藥物單用。由于肉桂醛和鹽酸小檗堿是中藥中的天然活性成分，植物資源豐富，且在長期臨床應用中少見不良反應和毒副作用。因此，肉桂醛、鹽酸小檗堿聯合氟康唑聯合應用的協同作用為今后抗真菌治療提供了新的思路。

參考文獻：

[1]譚心，王和，苑天紅，馬妍.肉桂醛與鹽酸小檗堿聯合氟康唑抗白念球菌作用的體外實驗觀察[J].遵義醫學院學報，2013，36（3）：221-224.

[2]劉奇，白麗.白念球菌磷酸酯酶B的研究進展[J].中國熱帶醫學，2008，8（13）：1050-1052.

[3]唐冰，朱家源等.187株深部感染真菌的菌群分布及耐藥性分析[J].中國熱帶醫學，2007，7（3）：407-424.