PON1基因多態性與原發性肝癌的相關性

【摘要】目的 檢測原發性肝癌病人與正常人PON1基因的多態性。方法 對121例原發性肝癌病人和100正常人運用SnapShot 技術檢測PON1基因（rs854552、rs662、rs757158、、rs854573、rs705382）這5個位點的表達。結果 原發性肝癌病人與正常人的PON1基因（rs854552、rs662、rs757158、、rs854573、rs705382）這5位點的表達P>0.05.結論 PON1基因多態性與原發性肝癌無一定的相關性

【中圖分類號】R4 【文獻標識碼】B 【文章編號】1671-8801（2014）02-0107-02

原發性肝癌（HCC，以下簡稱肝癌）是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，全球發病率逐年增長，已超過65萬/年， 居于惡性腫瘤的第5位； 死亡接近62.3萬/年，位居腫瘤相關死亡的第3位。HCC在我國高發，目前，我國發病人數約占全球的56%；在腫瘤相關死亡中僅次于肺癌，位居第二。因此，肝癌嚴重威脅我國人民健康和生命.目前已證實PON1基因M和Q等位基因的出現頻率和乳腺癌發病風險呈正相關，同時表現為MM型和QQ型基因的個體更易誘發乳腺癌（參考文獻1）、另有實驗證明檢測血清PONI的活性可以作為肺癌患者與前列腺癌患者的輔助檢查項目之一（參考文獻6）、也有報道顯示PON1基因與2型糖尿病的發生有關（參考文獻7）。而關于肝癌的研究甚少，本實驗運用SnapShot 技術深入研究PON1基因多態性（rs854552、rs662、rs757158、、rs854573、rs705382）與原發性肝癌發生的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本實驗選取 2008 年至2012 年在浙江大學附屬第一醫院肝膽胰中心住院的手術患者，經實驗室及影像學等檢查，臨床診斷為原發性肝癌，行原發性肝癌根治手術，所有患者皆經術后病理明確診斷為肝細胞癌，121例原發性肝細胞肝癌病人的外周血標本，其中男性73 名，女性48名，年齡28歲至71歲，平均45.3歲，HBsAg陽性115例，陰性6例；AFP陽性87例，陰性34例。對照組100例均來自2010年3月～2012年4月間，在浙江大學附屬第一醫院采集的體檢正常人靜脈血樣。體檢結果均正常，無肝硬化、乙肝相關病史、糖尿病等疾病，且一級親屬無HCC病史。其中男性56 名，女性44名，年齡21歲至69歲，平均39.4歲，HBsAg，AFP均陰性。研究對象均有完整的臨床資料，均簽署知情同意書。

1.2 DNA提取

運用Promega maxwell@16機器提取DNA，大約40 分鐘后，提取DNA 程序完成。將收集管中大約210μl 的DNA 溶液轉移至凍存管。凍存管在-80℃冰箱保存

1.3 PON1基因的多態性分析

運用SnapShot 技術進行PON1基因的多態性分析。

1.3.1 PCR反應體系及反應條件 反應體系：（20μl）包含1x HotStarTaq buffer， 3.0 mM Mg2+， 0.3 mM dNTP， 1 U HotStarTaq polymerase （Qiagen Inc.） 和 1 μl 樣本DNA。 反應條件：95oC 2min； 11 cycles x （94oC 20s， 65oC-0.5oC /cycle 40 s， 72 oC 1min30s）； 24cycles x （94oC 20s， 59oC 30s， 72 oC 1min30s）； 72oC 2 min； 4 oC for ever

1.3.2 PCR產物純化 在15μl PCR產物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37 oC溫浴1小時， 然后75oC滅活15分鐘

1.3.3 SNaPshot多重單堿基延伸反應

1.3.4 延伸產物上ABI3730XL測序儀 取0.5μl 純化后的延伸產物，與0.5μl Liz120 SIZE STANDARD， 9μl Hi-Di 混勻， 95 oC變性5分鐘后上ABI3730XL測序儀，收集的原始數據用 GeneMapper 4.1 （AppliedBiosystems Co.， Ltd.， USA） 來分析。

1.4 結果

實驗結果數據顯示PON1基因多態性（rs854552、rs662、rs757158、rs854573、rs705382），他們的位點等位基因頻率比較差異無統計學意義（P>0.05）。經這些位點的共性，特性分層后分析差異扔無統計學意義（P>0.05）（表1）（表2）（表3）（表4）（表5）

1.5 討論

對氧磷脂酶（paraoxonase，PON）是一類芳香酯酶，它能催化磷酸脂鍵水解，降解有機磷酸芳香羧基脂及氨基甲酸脂等。PON基因家族至少有3個成員即PON1、PON2、PON3，PON1基因位于人類第7號染色體短臂7q21-22，含9個外顯子和8個內含子，具有多種多態性。目前發現人體內PON1活性與動脈粥樣硬化、肝臟炎性疾病在內的很多疾病密切相關。血清PON1活性的降低數值可作為慢性肝炎和肝硬化患者肝臟損傷程度的指征。實驗證明，體內PON1通過與HDL結合發揮強大的抗氧化功能，通過降低肝組織的氧化壓力，阻止肝臟脂質過氧化等機制緩解肝臟纖維化的進程，降低肝損傷的程度（參考文獻2）。

目前已有文獻報道PON1基因，M和Q等位基因的出現頻率和乳腺癌發病風險呈正相關，對于PON1基因，M和Q等位基因的出現頻率和乳腺癌發病風險呈正相關，同時表現為MM型和QQ型基因的個體更易誘發乳腺癌。另有實驗證明原發性肺癌患者血清中PON1活性顯著降低 其靈敏度和特異性符合一般檢驗的要求，因此檢測血清PONI的活性可以作為肺癌患者與前列腺癌患者的輔助檢查項目之一，也有報道顯示PON1基因與2型糖尿病的發生有關，而已經有報道證實2型糖尿病是原發性肝癌的獨立危險因素之一，因此本次研究希望檢測PON1基因的多態性（rs854552、rs662、rs757158、rs854573、rs705382）發現與原發性肝癌發生的相關性。

本研究尚未發現PON1基因多態性（rs854552、rs662、rs757158、rs854573、rs705382）與HCC發病有顯著相關性，其中一個可能原因在于目前收集的病例數量偏少。由于實驗中對照組基因頻率的高低會直接影響最終統計學結果的判斷，若對照組的基因頻率低，則更加容易得到陽性結果。現階段實驗對照的病例數量偏少，可能會使預期實驗目標產生一定的偏離。另一原因可能是沒有檢測PON1基因多態性全部的位點，以致一些可以與原發性肝癌相關的位點遺漏。所以今后在該課題的進一步研究中，不僅需要擴大樣本的數量，還應該檢測基因多態性的全部位點，從而使實驗結果盡可能達到預期的目標。本研究的實驗結果對于進一步研究肝癌發生的相關性有一定的參考意義。

參考文獻：

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