基于分子信標(biāo)的DNA自組裝模型研究

摘 要：分子信標(biāo)操作簡(jiǎn)單且不必與未反應(yīng)的探針?lè)蛛x即可進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，將分子信標(biāo)與自組裝結(jié)合，將為DNA計(jì)算研究提供新的思路及方法。本文介紹了基于分子信標(biāo)的DNA自組裝模型的算法思想，闡明了分子信標(biāo)設(shè)計(jì)要點(diǎn)，描述了生物實(shí)現(xiàn)步驟，并對(duì)如何提高分子信標(biāo)的檢測(cè)準(zhǔn)確性做了展望。

關(guān)鍵詞：分子信標(biāo) 自組裝 DNA計(jì)算

中圖分類號(hào)：TP2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-9795（2014）05（a）-0115-02

Model Study of Self Assembled Molecular Beaeon Based on DNA

Zhang Wenyi Zhang Zhe Li Nan

（Anhui University of Science and Technolgy，AnhuiHuainan，232001 China）

Abstrat：Molecular beacon owns simple operation and can do real-time detection without separate the unreacted probes. The combination of molecular beacon and self-assembly will provide a new and effective method of studying DNA computing.This article introduces the algorithm ideas of DNA self-assembled model based on molecular beacon，clarifies molecular beacon design points，describes the biological implementation steps and do prospect of how to improve the detection accuracy of molecular beacons.

Key Words：Molecular Beacon；Self-Assembly；DNA Computing

自20世紀(jì)80年代中期開(kāi)始并已完成的人類基因組計(jì)劃為理解所有生命活動(dòng)的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。其中最早出現(xiàn)的是與DNA相關(guān)的基因組學(xué)，它是一門解碼生命所有信息的新的前沿科學(xué)。基因是細(xì)胞和個(gè)體遺傳信息貯存和傳遞的基本單位，遺傳信息的載體是以DNA和RNA兩大類核苷酸為基本組成單位的核酸。生命科學(xué)研究需要能夠高靈敏度、高選擇性地定量研究基因組和蛋白組的信息，而研究這些的基礎(chǔ)是對(duì)核酸的研究檢測(cè)。

核酸的基本組成單位為核苷酸，核苷酸間的差異主要是堿基不同，因此核苷酸序列可以用堿基序列表示。1953年，J.Watson和F.Crick發(fā)表了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的論文[1]，這一發(fā)現(xiàn)既是分子生物學(xué)發(fā)展的里程碑，又是核酸分子探針的理論基礎(chǔ)。分子信標(biāo)作為一種新型的熒光探針，以特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、可對(duì)核酸進(jìn)行實(shí)時(shí)定量測(cè)定、甚至可用于活體分析的特點(diǎn)在生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。

1 核酸雜交原理與分子信標(biāo)

1.1 核酸雜交原理

DNA的變性與復(fù)性是核酸分子雜交的原理。在某些理化因素的作用下如溫度、pH、離子強(qiáng)度等，DNA雙鏈互補(bǔ)堿基對(duì)間的氫鍵斷裂，使得DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)成為單鏈的現(xiàn)象即為變性。DNA變性不改變它的核苷酸序列，只改變其二級(jí)結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)室最常用的方法之一是加熱。DNA變性從開(kāi)始解鏈到完全解鏈，紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度。變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條互補(bǔ)鏈重新配對(duì)恢復(fù)天然雙螺旋構(gòu)象的現(xiàn)象稱為復(fù)性。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后復(fù)性的過(guò)程稱為退火。DNA的復(fù)性速度受溫度的影響，如要使其復(fù)性，需要溫度緩慢下降。若在加熱后將其迅速冷卻至低溫，則幾乎不能復(fù)性。DNA復(fù)性的最佳溫度一般認(rèn)為比Tm低25℃。

1.2 分子信標(biāo)

分子信標(biāo)是1996年Tyagi和Krammer[15]首次提出的一種熒光核酸探針，又稱為發(fā)卡探針。分子信標(biāo)一般由環(huán)狀區(qū)、莖桿區(qū)、熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)三部分構(gòu)成。環(huán)狀區(qū)是一個(gè)長(zhǎng)度為15-30堿基的環(huán)狀寡聚核苷酸序列，可以特異性與目標(biāo)分子結(jié)合，莖通常是長(zhǎng)度為5-8堿基的互補(bǔ)序列，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分別連在信標(biāo)分子的5’端和3’端。自由狀態(tài)時(shí)，莖桿區(qū)互補(bǔ)序列特異性結(jié)合形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，猝滅分子吸收熒光分子發(fā)出的熒光并以熱能散發(fā)，熒光幾乎完全被猝滅，檢測(cè)不到熒光信號(hào)。當(dāng)有靶序列存在時(shí)，分子信標(biāo)的環(huán)序列可與序列完全互補(bǔ)的靶標(biāo)分子形成比莖環(huán)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的雙鏈雜交體，莖桿互補(bǔ)區(qū)被拉開(kāi)，熒光分子與猝滅分子因距離增大而分開(kāi)。根據(jù)Foerster理論，中心熒光能量轉(zhuǎn)移效率與兩者距離的6次方成反比。此時(shí)猝滅分子無(wú)法吸收熒光分子發(fā)出的熒光，信標(biāo)分子的熒光幾乎完全恢復(fù)，于是可檢測(cè)到熒光，且所檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度與溶液中靶標(biāo)的量成正比（如圖1、圖2）。

2 DNA自組裝

DNA分子自組裝是指一些帶有輸入信息的DNA分子根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在一定的溫度、濃度、酸堿度以及特定酶的作用下，自組裝生成帶有輸出信息的新的DNA分子的過(guò)程。自組裝本身就是在執(zhí)行實(shí)際的計(jì)算，經(jīng)由退火使DNA序列根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行結(jié)合是它的動(dòng)力。自組裝DNA計(jì)算模型是通過(guò)DNA分子間的相互作用形成特定的構(gòu)型來(lái)完成計(jì)算過(guò)程，在思想上組合了DNA計(jì)算、Tiling理論和DNA納米技術(shù)，在計(jì)算過(guò)程中，它避免了其它DNA計(jì)算模型所需要的大量實(shí)驗(yàn)操作次數(shù)，減少了操作帶來(lái)的時(shí)間耗費(fèi)和誤差傾向，是目前備受關(guān)注的模型之一。

3 基于分子信標(biāo)的DNA自組裝模型

3.1 分子信標(biāo)的設(shè)計(jì)

分子信標(biāo)的設(shè)計(jì)需要根據(jù)分子信標(biāo)識(shí)別區(qū)在被其互補(bǔ)鏈雜交時(shí)產(chǎn)生的張力和分子信標(biāo)莖桿的鍵能設(shè)計(jì)其莖桿長(zhǎng)度。若環(huán)狀區(qū)過(guò)短，則很容易和非靶序列結(jié)合導(dǎo)致信標(biāo)分子結(jié)構(gòu)破裂。若莖桿部位很短，則環(huán)狀識(shí)別區(qū)會(huì)因和其他寡聚核苷酸結(jié)合而拉開(kāi)莖干，莖干很長(zhǎng)，則會(huì)導(dǎo)致環(huán)區(qū)結(jié)合靶序列后也打不開(kāi)發(fā)卡結(jié)構(gòu)。通常探針序列要比莖桿區(qū)序列長(zhǎng)兩倍以上。因吡啶分子的二臂可以分別與兩個(gè)鳥(niǎo)嘌呤G形成穩(wěn)定的三個(gè)氫鍵，可以設(shè)計(jì)一些鳥(niǎo)嘌呤G-C的非匹配對(duì)在分子信標(biāo)的莖桿部分，定向誘導(dǎo)非匹配對(duì)形成雜交分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

影響分子信標(biāo)的因素還有溫度、pH、分子信標(biāo)的純度等。分子信標(biāo)的熔鏈溫度取決于莖桿區(qū)長(zhǎng)度、G-C含量以及緩沖液離子強(qiáng)度，在較低溫度時(shí)可保持穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在較高溫度會(huì)破壞穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)而發(fā)出熒光。pH過(guò)高，莖桿區(qū)堿基對(duì)之間的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)也會(huì)被破壞，使分子信標(biāo)變性而產(chǎn)生熒光。雜質(zhì)的存在嚴(yán)重影響分子信標(biāo)的使用效果，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度降低，因此在使用分子信標(biāo)試劑之前要進(jìn)行嚴(yán)格的純化。

3.2 模型算法研究

自組裝計(jì)算模型由Winfree等學(xué)者首次提出[3]。自組裝計(jì)算模型的原理是由DNA序列的相互作用構(gòu)成特殊形態(tài)從而進(jìn)行計(jì)算。DNA自組裝實(shí)際上是構(gòu)造DNA分子結(jié)構(gòu)。在操作過(guò)程中將把單鏈DNA人工合成的過(guò)程稱為DNA雜交。雜交DNA分子具有特殊的粘性末端，因此它易于結(jié)合那些一樣具有粘性末端的DNA分子，而進(jìn)一步促進(jìn)DNA分子組裝。

DNA計(jì)算模型主要分為三步。

（1）生成給定問(wèn)題所有可能解。

（2）利用生化反應(yīng)的并行性，高速刪除非解。

（3）檢測(cè)問(wèn)題最終解。

發(fā)夾DNA計(jì)算模型是由Sakatomo等人首次提出。其基本思想是通過(guò)合理編碼，將錯(cuò)誤解編碼成可以在計(jì)算過(guò)程中形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并在每個(gè)編碼的DNA分子中加入某些內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基，這樣就可以在發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤解后將形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)清除。將分子信標(biāo)作為自組裝單元，是因?yàn)榉肿有艠?biāo)在一定條件下能夠直接將溶液中的核酸序列信息轉(zhuǎn)化為熒光信息，簡(jiǎn)化了檢測(cè)DNA計(jì)算的最終解，而且分子信標(biāo)可精確到單個(gè)堿基，大大減弱了與環(huán)部序列單個(gè)堿基錯(cuò)配時(shí)所誘發(fā)的熒光信號(hào)，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

算法的生物實(shí)現(xiàn)步驟如下。

對(duì)問(wèn)題進(jìn)行抽象并在DNA鏈上編碼分子信標(biāo)；在實(shí)驗(yàn)設(shè)施中加入所有約束條件中所包含的雙鏈DNA分子，通過(guò)一系列反應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)包括大量不同DNA雙鏈的大型數(shù)據(jù)池；升高實(shí)驗(yàn)溫度使數(shù)據(jù)池中的DNA鏈發(fā)生變性反應(yīng)從而解鏈成兩條單鏈DNA，然后將溶液稀釋，使得單鏈序列可自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；通過(guò)分子信標(biāo)產(chǎn)生的熒光判斷非解，切割所有形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)；加熱解鏈，清洗掉所有雜交的補(bǔ)；退火重新形成分子信標(biāo)；重復(fù)進(jìn)行步驟3，4，5，6，排除所有的非解；對(duì)沒(méi)有切割水解掉的DNA鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可得到最終解。

4 結(jié)論與展望

作為一個(gè)DNA計(jì)算模型，這種方法具有并行的執(zhí)行過(guò)程[4]，低能耗和計(jì)算高速性。分子信標(biāo)靈敏度高，選擇性好，無(wú)需洗脫，且分子信標(biāo)對(duì)堿基錯(cuò)配分析時(shí)錯(cuò)配位點(diǎn)所在位置沒(méi)有要求，靶序列錯(cuò)配堿基所在位置的改變不影響反應(yīng)結(jié)果，使得探針的設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)單，比普通線型核酸探針有更大的靈活性。將分子信標(biāo)與DNA自組裝結(jié)合，具有極大的研究?jī)r(jià)值。當(dāng)然也有很多的缺點(diǎn)：如不夠自動(dòng)化，發(fā)展空間不足，計(jì)算速度雖快但是得到結(jié)果和數(shù)據(jù)的速度卻很慢。

DNA分子解鏈溫度Tm的高低與其分子大小及所含堿基中G和C所占的比例相關(guān)，G和C含量越高值越高，且可由DNA分子大小及其GC含量計(jì)算，計(jì)算公式為：Tm=69.3+0.41（%G+C），小于20bp的寡核苷酸片斷的Tm值可用公式Tm=4（G+C）+2（A+T）計(jì)算。溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響極其重要，因此尋找實(shí)驗(yàn)溫度的一致性，有助于提高計(jì)算結(jié)果的準(zhǔn)確性。開(kāi)發(fā)不同的猝滅劑也是提高熒光猝滅效率和檢測(cè)靈敏度的一個(gè)研究方向，如增強(qiáng)熒光基團(tuán)的信號(hào)，使用高效猝滅劑提高猝滅基團(tuán)對(duì)熒光基團(tuán)的猝滅效率，同時(shí)將多個(gè)猝滅基團(tuán)修飾在分子信標(biāo)上等。

參考文獻(xiàn)

[1]Watson J D，Crick F H C.Molecular Structure of Nucleic Acids： A Structure for Deoxyribose[J].Nature，1953，171（25）：737-738.

[2]Tyagi S，Krammer F R.Molecular Beacons：Probes that Fluoresce Upon Hybridization[J].Nat Bioteehnol，1996，14：305-308

[3]Winfree E.Design and self-assembly of two-dimensional crystals.Nature，1998，394：1223-1226.

[4]Ogihara M，Ray A，Executing parallel logical operations with DNA，IEEE，1999.