西瓜抗病基因工程研究進展

摘 要：西瓜是一種重要的世界性園藝作物，但生產中病害嚴重，抗病種質資源匱乏，遺傳基礎狹窄，常規抗病育種進展緩慢，利用基因工程改良其抗病性具有重大意義。筆者從西瓜離體培養、遺傳轉化系統、抗病基因工程中相關目的基因、常用轉基因方法、導入目的基因的種類、轉基因植株的表現和轉基因產品的安全性等方面對西瓜抗病基因工程研究進展做一綜述，并進一步提出和討論了該領域尚待解決的問題，以期為通過基因工程手段改良西瓜抗病性提供幫助。

關鍵詞：西瓜；抗病基因；基因工程；安全性

中圖分類號：S651，Q78 文獻標志碼：A 論文編號：2013-0758

Abstract： Watermelon is an important horticultural crop worldwide， but there are many diseases in its production. For the narrow genetic base， watermelon conventional breeding for disease resistance has been slow. In this paper， watermelon resistance gene cloning， establishment and optimization of tissue culture and genetic transformation system， commonly used transgenic methods， types of target genes into transgenic plants' performance and the safety of genetically modified watermelon research progress were summarized. Some problems in this field， which would be investigated further， were also pointed out and discussed. These conclusions will contribute to genetic engineering application in improving watermelon disease resistance.

Key words： Watermelon； Resistance Gene； Gene Engineering； Security

0 引言

西瓜[Citrullus lanatus （Thunb.） Mansfeld]是具有重要經濟價值的葫蘆科（Cucurbitaceae）作物，世界各地廣泛栽培，在全球十大果品中排在第5位。目前西瓜栽培中普遍存在病害嚴重的問題，各栽培區主要病害可達10多種，其中尤以枯萎病等土傳性病害危害嚴重[1]。對于病害的防治主要采用化學防治，但由于生產中連作現象嚴重，病源變異廣泛，防治效果不佳。抗病性是衡量一個品種好壞的重要指標，如果品種本身抗病性較差，其他優良性狀也無從體現。由于抗病育種材料嚴重缺乏，西瓜抗病育種研究工作進展緩慢[2]。

20世紀80年代初首例轉基因煙草的問世標志著植物基因工程的成功，經過30年的發展，植物基因工程的理論和實踐逐步走向成熟和完善，并成為現代生物技術的核心領域，亦是農作物品種改良的重要手段。基因工程在增加作物產量、提高品質、增強對生物和非生物逆境的抗性方面取得了重大突破，經濟和社會效益明顯。統計數據顯示，全球轉基因作物商業化種植面積在1996—2011年的15年間呈現連續增長勢頭，2011年全球共有29個國家種植轉基因作物，面積達到創紀錄的1.6億hm2，生產的農作物價值超過1600億美元，轉基因研究及其產業化發展顯示出了蓬勃的生機。通過轉基因技術來增強植物的抗病性是基因工程的一個重要方面，對于西瓜等遺傳基礎狹窄的園藝作物而言這一途徑顯得更為重要，筆者將對西瓜抗病基因的克隆、遺傳轉化體系和導入的抗病目的基因類型等幾個方面的進展做一綜述，為基因工程在西瓜抗病育種中的應用提供參考。

1 西瓜自身抗病基因篩選和克隆

獲得抗病基因是利用基因工程改良作物抗病性的第一步，對西瓜抗病基因的克隆工作主要集中在相關分子標記的開發上，針對的病害主要包括枯萎病、病毒病、炭疽病、白粉病等，如與西瓜抗枯萎病1號生理小種[3]和抗西葫蘆黃葉病毒等[4]相關基因的SCAR標記相繼被發現。目前真正獲得直接相關的抗病基因尚未見報道，西瓜抗病基因工程中的目的基因大多來源于其他物種，相關分子標記的深入研究使得抗病基因的克隆成為可能，如徐向麗等[5]利用RAPD和SSR標記技術將抗西葫蘆黃葉病毒基因zym-CH初步定位在遺傳圖譜3號連鎖群105 cM處，但總的來說目前獲得的分子標記多態性較差[6]，和抗病基因的距離較大，使得對這些標記的有效利用較為困難，急需開發新的多態性更強的分子標記。Levi等[7]指出不同西瓜種質間豐富的單核苷酸多態性（SNP），這一特點使得獲取更多抗病基因相關分子標記成為可能，其他研究者的結果表明微衛星標記、RGAs標記等在西瓜中的多態性也較為豐富[8-10]，上述這些研究為西瓜抗病基因的定位與克隆奠定基礎，也可作為抗病輔助選擇的分子標記。

2 西瓜轉基因方法研究

2.1 西瓜離體再生體系的研究

目前除種質轉化系統外幾乎所有的轉基因方法均需要經過組織培養階段，這一過程涉及到外植體的選取、抗性植株的再生、外源基因功能的初步驗證等各方面。高效的離體再生系統是植物基因工程獲得成功的有效保障。目前關于西瓜組織培養的研究報道較多，但結論不盡相同。總體來看，與其他同類植物相比，西瓜的離體再生能力率不高，玻璃化現象較為嚴重，再生苗不易移栽成活。

2.1.1 激素種類和濃度的影響 大多數研究者認為BA在西瓜外值體不定芽誘導分化過程中作用重要，在培養基中加入較低濃度的生長素對這種分化有一定的促進作用[12-15]，但也有不同的結論，如Compton等[16]認為BA濃度的變化對于西瓜不定芽的誘導影響輕微，添加IAA后誘導產生的愈傷組織生長過度，不定芽的分化則會被抑制，其他研究者的試驗[17]表明，即使在不提供任何激素的1/2MS培養基上外植體也可以獲得再生，只是這種分化所需時間相對較長。

2.1.2 品種基因型和植株苗齡的影響 不同基因型的品種再生率明顯不同，在用西瓜不同品種子葉作為外植體的研究中已證明了這一點[18]，目前大多數相關研究均支持這一觀點。處于不同苗齡的植株，離體培養過程即使選用同樣部分的外植體，其生理狀態也不盡相同，這對于外植體的再生率影響也極為重要。研究表明西瓜苗齡5天時外值體誘導率最高，但不同基因型間存在較大差異，超過10天苗齡的子葉誘導不定芽極為困難[19]，也有研究者認為西瓜7天苗齡的子葉誘導效果最好[20]，張志忠等[13]提出西瓜苗子葉處于轉色期的誘導率最高，這種鑒別方法避免了由于基因型、種子質量和培養條件差異而導致的以天數來衡量苗齡的不足。

2.1.3 不同類型外植體的影響 在西瓜離體培養研究中，莖、葉和體胚等外植體均有成功報道[21]，但各種類型的誘導率不盡相同，如Eissa等[22]認為子葉更容易誘導，Islam等[23]則認為胚軸較子葉更為有效。總的來看，目前在西瓜離體培養和基因轉化工作中子葉塊和頂芽是最為常用的外植體類型[24]。其他，如原生質體[25]和體胚等外植體類型的誘導[26]也有相關研究，這類報道雖少，但增加了西瓜組織培養和轉基因工作中可用外植體的來源，有助于各種技術地充分運用。

西瓜離體培養中嚴重的玻璃化現象是必須引起重視的，這一情況在大多數研究中幾乎都會出現[25]，嚴重時會導致整個研究工作的徹底失敗。培養基和激素類型、瓊脂濃度、滲透調節物質、通氣情況等均與此有關，如質量濃度高的BA會加劇試管苗的玻璃化[21]，培養基中添加硫胺素則會在一定程度上緩解這一情況[27]。西瓜再生苗誘導生根較為容易，但獲得的不定根質量不佳，數目偏少，且在移栽過程中極易斷裂，這在很多程度上影響了西瓜的組織培養研究工作[12]。由此可見，盡管西瓜離體培養研究工作已進行多年，相關報道也較多，但不同研究者獲得的結論差異較大，難以很好的重復，這說明其組織培養技術仍有待于進一步深入研究。

2.2 西瓜遺傳轉化體系的研究

2.2.1 西瓜遺傳轉化方法的研究 目前西瓜基因工程中最常用的轉化方法為農桿菌法，Choi等[28]在1994年首次報道了高效的農桿菌介導的西瓜遺傳轉化系統，此后不同的研究者先后對這一系統進行了優化和改進，目前已較為成熟。西瓜基因槍遺傳[29]和發根農桿菌[30]轉化系統也有報道。近年來外源DNA直接轉化法在西瓜中獲得成功，肖光輝等[31]通過DNA浸胚將瓠瓜總DNA轉入西瓜，王果萍[32]和包文風等[33]均通過柱頭涂抹法成功將外源基因導入西瓜中；通過對T3代的田間自然抗病性和人工接菌鑒定獲得3個枯萎病抗性株系[32]。由此可見利用花粉管通道法等直接導入技術是可行的，這類方法操作簡單，不需要經過組織培養階段，轉化周期大為縮短，一旦將外源基因導入這些細胞，即可獲得較為穩定的轉化體。

2.2.2 西瓜農桿菌介導的遺傳轉化法 對農桿菌轉化條件進行的優化包括預培養時間、共培養時間、菌液濃度、侵染時間和輔助物質的添加等內容。張志忠等[34]對西瓜農桿菌法進行了深入系統研究，指出利用子葉為外植體的遺傳轉化體系指標為對子葉塊外植體進行2～3天的預培養，侵染用工程菌液OD600值為0.3，侵染時間10 min，共培養時間為4天，其他研究者的結論也大致類似。基因工程試驗中需要通過適當的選擇壓力將轉化個體篩選出來，一般采用抗生素或除草劑來實現這一目標。植物基因工程中常用的抗生素包括氨芐青霉素、羧芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、鏈霉素、四環素和潮霉素等，研究表明15 mg/L的潮霉素篩選抗性芽較為合適，卡那霉素會增加玻璃化比例，500 mg/L頭孢霉素和羧芐青霉素均可用于共培養后的脫菌過程[34-35]，但也有研究者認為卡那霉素更適合篩選西瓜抗性芽[36-37]。不同來源材料的最佳侵染時間需經試驗確定，過長會由于培養環境缺氧導致外植體腐敗死亡，過短侵染效率低，轉化難以發生；此外培養基中是否需要添加酚類物質、小分子量糖類和乙酰丁香酮等也屬于這部分的研究內容，對于轉化率不夠高的受體系統，這些研究顯得非常必要，有時甚至對轉化事件的發生起決定性作用。

3 抗病基因工程在西瓜中的應用

目前西瓜抗病育種工作中主要的問題是缺乏相應的抗病資源，這使得利用傳統育種技術改良西瓜抗病性極為困難。利用基因工程將抗病基因導入西瓜，有望得到抗病品種或供進一步育種選用的材料，目前這類研究主要集中在抗病毒和真菌2個方面，但相對于番茄等園藝植物而言，西瓜的抗病基因工程研究突破較少，無論是在抗病基因的克隆還是轉基因植株的利用等方面均存在一定差距，相關研究具有一定的困難，進一步深入探討這一問題極為重要。

3.1 抗病毒病基因工程

病毒病是造成農作物減產的重要原因，全球每年因此造成的損失高達約200億美元，西瓜遺傳基礎狹窄，常規雜交抗病毒育種進展緩慢。西瓜花葉病毒外殼蛋白基因[38]和銀斑病毒外殼蛋白基因[27]先后被導入西瓜，與對照相比轉基因株系發病時間推遲，發病程度減輕。鑒于病毒的多樣性和易于變異，將多個病毒外殼蛋白基因同時導入西瓜是目前研究的重點[39-41]，同時導入西瓜花葉病毒CP基因、西葫蘆黃葉病毒和黃瓜花葉病毒復制酶基因的4倍體轉基因西瓜，目的基因在后代中能穩定遺傳，經溫室及大田接種鑒定，T3代轉基因西瓜抗病毒性達中抗水平[39]；導入4個病毒外殼蛋白基因片段的轉基因西瓜植株抗病性增強，可以抵抗多種病毒，但在轉基因后代中部分基因片段丟失了[41]。關于西瓜抗病毒基因工程的報道較多，由最初的導入一個基因，逐步發展為同時導入多個基因；通過微小RNA轉化增強抗病毒能力等新技術逐步發展起來，這些對于西瓜獲得持久、廣泛的抗病毒能力大有裨益。

3.2 西瓜抗真菌病害基因工程

植物生長發育過程中由真菌侵襲所致的病害所占比例最大，是嚴重影響園藝作物產量、質量的主要因素。經過多年的發展，植物抗真菌基因工程技術已日趨成熟。張志忠等[42]首先將來源于番茄的葡聚糖酶基因和幾丁質酶基因同時轉入西瓜，抗病性檢測顯示轉基因植株的抗真菌能力有一定程度的提高，其他研究者也有類似的報道[43]。肖守華等[35]進一步添加了小麥硫堇蛋白基因，獲得了3價抗真菌融合基因載化西瓜，轉基因植株高抗真菌，人工接種病原菌后幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶活性較非轉基因對照高5～6倍。此外，研究表明將瓠瓜DNA整體導入西瓜可以獲得性狀穩定的抗枯萎病育種材料[31]。

4 西瓜基因工程產品安全性研究

隨著基因工程在園藝植物改良中的應用日趨普遍，轉基因園藝植物的安全性問題也日益引起人們的重視，一個是環境安全性，另一個是食品安全性。環境安全性研究主要指對轉基因植物釋放到田間所可能引發的一系列風險的研究，為了防止轉基因植物中外源基因擴散，必須實行風險評估，Kim等[43]通過小規模的田間試驗證明了轉基因西瓜中的外源基因會漂流到非轉基因西瓜中去。食品安全性研究主要是對轉基因植物本身和以轉基因植物為材料所生產的食品被人畜食用后可能存在的風險進行的研究，由于園藝植物在人類食品中占有重要地位，是提供各種營養物質的主要來源，和人們健康水平息息相關，這類研究顯得極為必要。應奇才等[45-46]對轉抗病毒基因西瓜的農藝性狀進行的研究顯示，在長勢、生物學性狀、含糖量、越冬能力等性狀上轉基因植株和非轉基因對照沒有顯著差異，其抵抗病毒的能力得到了顯著提高；毒性試驗、致突變試驗和小鼠30天喂養試驗表明轉基因西瓜對小鼠沒有毒性和致突變作用，屬安全食品。這是目前僅見的3篇關于轉基因西瓜安全性研究的報道，對于利用基因工程獲得優良西瓜品種，進而進行推廣種植而言，上述研究顯然是不夠的，需要進行更加深入的基礎研究和更大規模的食品安全性檢驗。

5 展望

應該說西瓜抗病基因工程研究取得了令人鼓舞的成績，但在抗病基因的克隆工作、獲得轉基因植株后的相關研究等方面存在一定不足，今后的研究工作應著重從以下幾個方面入手。①深入研究西瓜的組織培養體系，尤其應重視對組培過程中的玻璃化問題探討；②利用更為先進的分子標記等技術克隆西瓜新的抗病基因，這一工作可以結合最近完成的西瓜全基因組測序，優良的目的基因是西瓜抗病基因工程進一步應用的保障；③鑒于目前西瓜抗病基因工程中大多采用的是組成型表達模式，對于新型誘導性啟動子和組織特異型啟動子的克隆工作應給與高度重視，這方面的研究將在改良西瓜抗病性的同時盡可能減少對其他優良性狀的影響；④同時將多個目的抗病基因導入西瓜，充分發揮其在抗病機制方面的協同作用，使轉基因西瓜獲得對不同病原的持久性抗性；⑤西瓜屬于重要的園藝作物，食品安全性問題較為突出，對轉基因產品更加可靠的安全性評價工作必須進行，無標記轉化、利用自身來源基因進行轉化等方面的研究將有助于解決這一問題。

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