秋水仙素誘導木薯多倍體研究進展

陸柳英等

摘 要：木薯優良品種選育一直是木薯科研工作的重要任務，多倍體育種為木薯種質創新和新品種選育提供了一條重要途徑。筆者敘述了近年來國內外木薯多倍體育種研究進展。分析了國內外利用秋水仙素誘導木薯多倍體的技術方法、多倍體嵌合體分離策略以及鑒定手段，指出影響木薯多倍體誘導效果的幾個因素，并提出了木薯多倍體誘導研究目前存在的問題和未來的研究方向。

關鍵詞：木薯；多倍體；秋水仙素；研究進展

中圖分類號：S533 文獻標志碼：A 論文編號：2013-0464

Abstract： Cassava breeding has been the key task in the cassava consortium； and polyploid breeding provides an important way for the germplasm innovation and breeding of cassava. This paper briefly reviewed the progress of cassava polyploidy breeding at home and abroad. Some factors， such as the methods of inducing polyploidy by colchicines， the identification of polyploid， the techniques of dissolving chimeras， were emphatically summarized. The problems existed and the potential focuses were also discussed here.

Key words： Cassava； Polyploidy； Colchicine； Progress

0 引言

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科木薯屬植物，屬內有98個種，木薯是唯一的栽培種[1]。木薯淀粉含量高（20%～40%）、耐旱、耐貧瘠、耐酸性土壤，是熱帶地區第四大農作物和世界三大薯類作物之一。木薯可食用、飼用和作為工業原料，加工成淀粉、變性淀粉、酒精等，廣泛應用于食品、醫藥、紡織、造紙、生物質能源等諸多行業。在中國其主產區分布于廣西、廣東、海南、云南、福建等熱帶、亞熱帶地區。

植物多倍體現象普遍存在自然界中，這是高等植物染色體進化的顯著特征之一，是適應性變化和物種形成的主要機制[2]。染色體數目加倍，使多倍體個體通常表現出巨大性和營養成分高、抗逆性強、育性低的特點。木薯是良好的誘導多倍體作物。木薯多為二倍體，染色體數目為2n=36[3]，是無性繁殖、收獲營養體（木薯塊根）的作物。因此，木薯多倍體可通過直接選擇、固定而獲得，既有利于保持多倍體的穩定性，又能更好地利用多倍體的特點提高收獲產量和植株抗性。

目前通過多倍體育種方法創造新的種質也成為了育種研究的熱點之一，通過多倍體育種與傳統育種方法相結合，選育出抗旱、抗寒、抗病、高產、高淀粉的木薯多倍體品種，對擴大種質資源和促進木薯產業發展有重要意義。

1 木薯多倍體誘導方法

多倍體植株的產生途徑有自然產生和人工誘導。在自然條件下，機械損傷、射線輻射、溫度驟變及其他一些化學因素刺激，都可以使植物材料的染色體加倍，形成多倍體種群。通過篩選自然多倍體獲得新木薯品種的研究在國內外鮮有報道，尼日利亞伊巴丹曾發現1例由體細胞芽變產生的自然多倍體[4]，國內目前尚無有關木薯自然多倍體的報道[2]。

人工誘導方法有物理方法誘導、生物學方法誘導和化學方法誘導[5]。其中，以秋水仙素等化學藥劑處理加倍染色體的方法誘變作用專一性強、誘變突變廣譜、經濟方便，成為目前應用最普遍的方法。

國外對木薯多倍體的研究較早，1941年Graner[6]使用秋水仙素對木薯進行多倍體誘導研究，鑒定到植株染色體數目為72條，為四倍體，氣孔的平均長度為40 μm，而對照為28 μm。Abraham等[7]和Magoon等[8]也有采用秋水仙素人工誘導出木薯四倍體的報道。2006年Nassar[9]使用0.2%的秋水仙素溶液連續3次，每次間隔12 h，對包裹棉花的木薯腋芽進行處理，最終篩選獲得了木薯多倍體植株。

在國內，木薯多倍體誘導也多采用化學方法。1980年，華南熱帶作物科學研究院橡膠栽培研究所遺傳育種室，以優良甜種木薯6068為材料，采用混合化學誘變方法，獲得穩定的四倍體突變新品種[10]。陳顯雙等[11]利用秋水仙素作為誘導劑，對8個木薯品種進行多倍體誘導試驗。經形態學和染色體數目鑒定，變異后代顯示出多倍體特征。

2 秋水仙素誘導木薯多倍體方法研究

秋水仙素誘導植物多倍體的方法包括田間誘導和離體誘導。

2.1 田間誘導

秋水仙素田間誘導多倍體采用的處理方法主要有浸漬法、滴液法和注射法。

浸泡法多用在誘導種子或植物枝條嫩芽上。王建嶺[12]采用了種莖萌發芽浸泡藥劑法誘導，將沙床上木薯莖段萌發的嫩芽，在出芽2 cm左右時，浸泡在裝有秋水仙素溶液的小離心管中進行誘導處理。

滴液法可用于處理植物枝條芽點。陳顯雙[11]采用田間誘導方法，在木薯生長前期打頂，促進側芽萌發，用脫脂棉包裹腋芽生長點，以4 g/L的秋水仙素為誘變劑，采用滴液法處理，獲得變異枝條。

注射法可直接將秋水仙素溶液注射到需要誘導的植物部位。周香君等[13]采用微量進樣器將3種不同濃度的秋水仙素溶液注射處理大蒜蒜瓣生長點，篩選出0.1%的秋水仙素處理后的大蒜根尖染色體變異和氣孔的加倍效果表現最穩定。但此方法在木薯多倍體誘導研究在國內尚未見相關報道。

2.2 離體誘導

離體培養的材料一般是種子、幼苗、生長點、莖尖、愈傷組織、胚狀體、懸浮細胞系、小孢子、原生質體或單細胞等。秋水仙素離體培養誘導多倍體常用的方法有浸泡法、混培法、點滴法。

張健[14]分別使用SC8和ARG7 2個木薯品種的帶芽莖段、成熟子葉以及叢生芽為試驗材料，用秋水仙素進行浸泡法和混培法處理，誘導木薯多倍體，均發現了染色體加倍現象。譚德冠等[15]采用點滴法，將無菌脫脂棉沾不同濃度的無菌秋水仙素溶液后，包裹‘剛果12號桉下胚軸誘導出的愈傷組織和叢生芽，每天點滴1次，處理3天后用無菌水沖洗干凈后接種到新鮮培養基上，獲得了四倍體變異株。

2.3 影響秋水仙素誘導木薯多倍體效果的因素

2.3.1 誘變材料 誘變材料在很大程度上決定著誘變的效率。誘變材料一般選取植株組織分裂最旺盛的時期和部位。如種子、幼苗、生長點、莖尖、愈傷組織、胚狀體、懸浮細胞系、小孢子、原生質體或單細胞等。張健[14]在離體誘導多倍體研究中發現，同樣使用秋水仙素混培法，木薯叢生芽的誘變效率明顯高于帶芽莖段和子葉切塊。而采用浸泡法處理帶芽莖段時，對帶芽莖段先進行膨大培養3～5天可有效提高多倍體的誘變率。

2.3.2 誘導方法的選擇 田間誘導和離體誘導方法都能誘導多倍體，在選擇時要根據試驗材料選擇最佳的誘導方法。王建嶺[12]在田間誘導多倍體試驗中使用了2種方法，其中莖尖涂抹法優于萌發芽浸泡法。張健[14]在離體誘導多倍體時，采用浸泡法與混培法對SC8和ARG7木薯品種的帶芽莖段、成熟子葉和叢生芽多倍體進行誘導，其中，木薯SC8品種采用浸泡法處理帶芽莖段，誘變效果較好，誘變率達31.3%；而品種ARG7采用混培法處理叢生芽，誘變率較高，為36.7%。因此，不同基因型木薯間多倍體誘導率也存在較大差異。

2.3.3 處理濃度和處理時間 秋水仙素濃度是多倍體誘導的關鍵因素之一，濃度過低時不能產生加倍效果，而濃度過高又會抑制植物材料的生長甚至會導致死亡。陳顯雙[11]在田間木薯腋芽生長點誘導多倍體時，設定濃度范圍0.5～8 g/L，濃度越大，變異效果越好，但濃度過大，對植株損傷程度也加大，以4～6 g/L處理效果最好。

處理時間的長短也會直接影響成活率和誘變率。王建嶺[12]研究發現，浸泡法和混培法對組培芽莖尖誘導，在處理相對較短的時間內，成活率和誘變率比較高。如浸泡法處理2天后成活率最高達60%，誘變率最高達20%，處理4天后成活率最高僅10%，誘變率全部為0；混培法處理時間10天后成活率最高達50%，誘變率最高達30%，處理30天時，成活率最高達20%，誘變率全部為0。浸泡和混培對愈傷組織誘導時，隨著處理時間的增加，成活率和誘變率均有明顯下降趨勢。

另外，在進行誘導處理時，適當添加二甲基亞砜（DMSO）、甘油等輔助劑，可提高染色體加倍效果和減輕誘變劑毒害作用。DMSO作為滲透劑和增效劑，添加濃度一般為2%～4%[16]。張健[14]在木薯離體誘導多倍體試驗中，就在浸泡的秋水仙素溶液中添加了2% DMSO，取得了較好的誘變效果。

2.3.4 其他環境因素 光照情況對誘導率存在影響。由于秋水仙素見光易分解，整個誘導處理的過程都需在黑暗環境中進行。處理完成后，可將材料從暗培養到弱光培養、光照培養進行緩慢過度，有利于材料生長。張健[14]在秋水仙素離體誘導多倍體處理帶芽莖段、成熟子葉切塊、叢生芽試驗中，采用浸泡法時，處理過程全部在遮光條件下完成，處理結束后將材料先暗培養3天，再弱光培養3天，最后轉成光照培養；采用混培法時，處理過程也需在弱光條件下進行。

溫度也對誘變率存在影響。一定范圍內，溫度愈高，誘導效果愈好；溫度較高時，處理濃度可適當降低，處理時間應相應縮短。梁倩倩[17]在西瓜四倍體誘導試驗中發現，幼苗摘心后處理的溫度越低，成活率越高，誘導率也越高，在29℃時幼苗的成活率和誘導率高于32℃和35℃；不同處理時段比較試驗，以每天的17：00—18：00處理時存活率和誘變率最高，與8：00—9：00處理差異不顯著，12：00—13：00處理時誘變率最低。木薯田間多倍體誘導陳顯雙[11]選擇上午8：30—9：30進行藥劑處理，而王建嶺[12]則選擇在傍晚進行處理。

3 多倍體的鑒定

染色體是遺傳物質的載體。染色體數目的變化會導致形態、解剖、生理、生化等諸多遺傳特性的變化。目前多倍體的鑒定方法可分為形態學鑒定、細胞學鑒定、流式細胞儀鑒定、染色體計數法鑒定、分子生物學鑒定、生理生化鑒定等。

形態學鑒定是初步鑒定多倍體的方法，多倍體植株與二倍體植株相比，一般表現出器官或組織具有巨大性；細胞學鑒定作為多倍體鑒定的輔助指標，通過顯微鏡觀察葉片下表皮氣孔的大小和密度、保衛細胞的長度和寬度、保衛細胞中葉綠體的數目等，以及花粉粒發芽孔數目等指標進行鑒定；流式細胞儀鑒定時通過測定染色劑染色的細胞熒光密度確定細胞內DNA含量，從而檢測植株倍性的變化；染色體計數法鑒定是最直接和可靠的方法，馮斗、王超等[18-19]均對木薯根尖染色體的觀察技術進行了研究和改良，張健、凡杰等[20-21]以木薯嫩葉為材料，對木薯葉片染色體制片技術進行了研究，取得了良好的分裂相效果；分子生物學鑒定是利用RAPD或RFLP等技術對多倍體倍性與來源等進行研究；生理生化鑒定是通過測定一些生理生化指標，比較其與對照之間的變化，從而為倍性鑒定提供參考，如測定持水量、葉綠素含量、果實含糖量、維生素含量、光合作用等。

多倍體鑒定一般采用多種鑒定方法相結合。張健[14]在多倍體鑒定時，先通過形態學和細胞學鑒定篩選變異植株，再將篩選到得植株繼代培養后用染色體計數法對莖尖染色體數目進行鑒定，最后對鑒定為多倍體的植株，采用輔助鑒定測定葉片葉綠素含量以及葉片含水量。王建嶺[12]在鑒定多倍體時，也分別采用了根尖染色體計數觀察、外形比較鑒定、葉片下表皮氣孔密度和氣孔形態測定、葉綠素含量的測定和塊根淀粉含量測定。陳顯雙[11]則應用了形態學觀察和根尖染色體觀察法進行鑒定。

4 嵌合體分離與多倍體植株穩定培養

嵌合體現象在植株化學誘變過程中普遍發生，而秋水仙素誘導多倍體時也廣泛存在。嵌合體本身具有不穩定性，且多倍體細胞有可能不斷被二倍體細胞所取代，朱雪云等[22]對植物嵌合體的類型和穩定性進行了探討，并分析了扇形嵌合體、混合型嵌合體和周緣嵌合體的發生、轉換、穩定與利用。在木薯多倍體誘導研究中，如何進行多倍體嵌合體的分離并將多倍體植株穩定培養是關鍵。

王建嶺[12]在試驗中雖然鑒定到染色體有加倍現象，但是幾乎均為嵌合體，并且經繼代培養后，變異株的表現基本與正常株無差異。

張健[14]在離體誘導木薯多倍體時，認為嵌合體分離程序可考慮對秋水仙素處理后的材料暫不進行篩選，而是在植株恢復生長后株高3～5 cm時，進行一次單芽莖段繼代培養。繼代后植株經形態學鑒定，將篩選到的變異株切段后通過莖段腋芽膨大培養3～5天，然后挑取芽點進行叢生芽增殖培養，再對誘導出的叢生芽進行切割分離。如此反復進行直到獲得純合率髙的木薯多倍體植株。但在嵌合體分離試驗后是否獲得木薯多倍體植株，以及多倍體植株特性方面的研究，沒有后續報道。

陳顯雙[11]誘導木薯多倍體開始獲得的也多為嵌合體植株，有相當部分開始能觀察到變異，之后逐漸消失。其在試驗中采用的分離方法是：先選擇變異相分布較好且變異面積比較大的葉片，從其上方進行截桿，促進腋芽萌發，如此反復多次分離直到變異枝條上的葉片形態表現完全一致。該試驗獲得的變異枝條經過3～4代的無性繁殖后，后代體細胞遺傳學特征表現為二倍、三倍和四倍并存的混倍體，且以四倍體細胞占優勢。由此可見，該變異株很有可能是嵌合體植株。

5 問題與展望

5.1 木薯多倍體在國內應用較少

目前，在國內僅3～4個研究機構有開展木薯多倍體誘導方面的研究報道，并且均是采用秋水仙素誘導。根據資料顯示，有關獲得的多倍體植株表現情況的報道僅有2個：1980年的華南熱帶作物科學研究院（現中國熱帶農業科學院）培育出的木薯6068的四倍體植株，表現為抗葉斑病、生勢壯、桿粗、葉厚、結薯集中、早熟，且產量、淀粉含量、總糖含量均比二倍體高[10]。2008年陳顯雙等[11]描述，獲得的變異株3～4代無性繁殖后，其形態特征與對照相比，表現為葉片掌狀裂片變短、變厚、顏色加深，植株生長稍慢，株型較緊湊。

5.2 木薯多倍體誘導可嘗試新的誘變劑

秋水仙素目前在誘導加倍上應用最為廣泛，但因為秋水仙素有劇毒，人們一直在嘗試使用其他誘變劑進行替代。其中，已經發現的甲基氨草磷（APM）、戊炔草胺、安磺靈（Oryzalin）、氟樂靈（Trifluralin）等除草劑在誘導染色體加倍中具有很大的潛力，它們的作用機理和秋水仙素一樣[23-24]。可以將這些新型誘變劑在木薯多倍體誘導中研究使用，并繼續發掘更多使用安全、處理效果好的新型誘變劑。

5.3 對木薯嵌合體分離的時機把握和技術

嵌合體分離是木薯多倍體植株獲得的關鍵技術之一，也是一大難題。掌握進行嵌合體分離的時機和分離技術可以提高多倍體植株取得的效率。

根據木薯組織材料的區別，多采用組織連續切割分離法、莖段多次繼代分離法等，但目前還沒有研究將木薯嵌合體類型、發生部位及分離方法與多倍體純合度之間建立相關關系，將木薯分離或繼代的次數與多倍體純合度之間建立相關關系。這些研究的完善將使木薯嵌合體分離技術有重大突破。

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