入侵害蟲桔小實蠅檢測方法的研究發展概況

楊朗等

摘 要：文章首先歸納了重要的世界性檢疫害蟲-桔小實蠅的分布與為害等生物生態學特性，如其目前分布于中國的湖南、廣東、廣西、貴州、福建、四川、海南、云南、臺灣等省份或地區，為害近300種果蔬植物，主要為害果實，世代相互重疊，具有群集取食的習性。接著從形態鑒定檢測、聲波檢測及分子檢測3個方面概述了近年來桔小實蠅的檢測方法研究的發展趨勢及各檢測方法的優缺點，提出了為適應水果進出口貿易快速通關的大局進一步開展對桔小實蠅檢測鑒定新技術研究的迫切需要，最后提出了關于桔小實蠅研究的熱點問題，如生態適應規律及機制、擴散途徑及機制、可持續控制措施等。

關鍵詞：桔小實蠅；檢測方法；聲波；DNA條形碼

中圖分類號：Q966 文獻標志碼：A 論文編號：2013-0269

Abstract： Bactrocera dorsalis Hendel （Diptera： Tephritidae） is an invasive pest. Owing to its potential damages and rapid spread， it has been considered as an important quarantine pest in China. For improving the precaution of this invasive pest by all kinds of people， the biology and ecology of this pest were been introduced in this paper. At present， B. dorsalis have been found in many counts and provinces of China， such as Hunan， Guangdong， Guangxi， Guizhou， Fujian， Sichuan， Hainan， Yunnan and Taiwan. This pest is a polyphagous pest， which indicated that there were 300 host plants of them. Merit and demerit and development tendency of the detection method about B. dorsalis have been concluded from 3 methods just following： morphological identification， acoustic detection， molecular detection. And the developed current about this insect pest has been discussed at last of paper， including ecological adapted regular pattern and mechanism， diffusion path and mechanism， sustainable controlling methods and so on.

Key words： Bactrocera dorsalis （Hendel）； Detection Method； Sound Wave； DNA Barcode

0 引言

桔小實蠅是一種寄主范圍廣泛、危害嚴重的世界性檢疫害蟲，其幼蟲在果實中發育，對水果生產會造成毀滅性災害。為保護中國的農業生產和生態安全，必須制定嚴格的檢驗檢疫制度和防除措施，以防止桔小實蠅的傳播，而檢測方法則是影響水果進出口貿易通關速度和時間的關鍵，因此對其檢測方法的研究極其重要。筆者綜述了近年來桔小實蠅在檢測方面的研究進展情況，旨在為桔小實蠅檢測新方法的進一步研究開發提供一些參考。

1 桔小實蠅的分布

桔小實蠅[Bactrocera dorsalis （Hendel）]亦名黃蒼蠅、東方果實蠅、果蛆，隸屬雙翅目（Diptera）、實蠅科（Tephritidae）、寡鬃實蠅亞科（Dacinae）、果實蠅屬（Bactrocera）。該害蟲最先產于亞洲的熱帶和亞熱帶地區，而印度早在1916年已有報道[1]，1945年該蟲傳入夏威夷群島，目前已廣泛分布在亞洲以及環太平洋的多數國家和地區[2]，中國、東南亞、印度次大陸、夏威夷群島等均有該蟲的分布為害。中國于1911年首次在臺灣發現該實蠅[3]，1937年謝蘊貞報道中國大陸有該蟲的記錄。目前該蟲主要分布于湖南、廣東、廣西、貴州、福建、四川、海南、云南、臺灣等省份或地區[4-7]，在華中和華南地區已造成了嚴重危害。

桔小實蠅是一種寄主廣泛、危害嚴重的世界性檢疫害蟲，該蟲可為害46個科250多種植物[8]，給中國及許多國家和地區的農業生產造成了很嚴重的經濟損失。因此，世界上許多國家和地區都把該蟲列為重要的檢疫對象，在中國其被列為二類危險性害蟲[9]。隨著全球氣候變暖，桔小實蠅的分布范圍會逐漸擴大[10]，在國內的擴散呈自南向北擴散的趨勢[11]。同時隨著國內和國際貿易的日益發展和頻繁，桔小實蠅的入侵擴散途徑不再局限于自然狀態下的擴散為害，它會隨著果蔬植物的調運入侵擴散到新的區域造成為害。

2 生物生態學特性

據報道，桔小實蠅可為害柑桔、柚子、芒果、枇杷、甜橙、番石榴、葡萄、桃、李、番茄、楊桃、石榴、辣椒、香蕉、茄子、苦瓜等近300種果蔬植物，其常常造成瓜果腐爛，被稱為瓜果的“頭號殺手”。此蟲主要為害果實，具有群集取食的習性。成蟲產卵時，在果實的表面先形成傷口，致使汁液大量溢出，然后產卵孔處就開始慢慢腐爛[9]。同時，產卵時形成的傷口很容易導致病原微生物入侵；卵產于果皮下，幼蟲孵化后即可鉆人果實內取食，嚴重時可導致果實組織軟化至腐爛，造成大量的落果，為害輕微時，致使果品品質等級降低[12]。

桔小實蠅每年發生3～6代，多數地區以第3代為主害代，無嚴格的越冬過程；世代相互重疊，各世代發生不整齊，同一時期可見各種蟲態。成蟲一年四季均可以在野外活動，雌蟲對甲基丁香酚有趨向性，可利用此特性引誘雌成蟲[9，12-13]。

3 檢測方法

3.1 形態鑒定檢測

早期對桔小實蠅的鑒定主要應用傳統的成蟲形態鑒定方法。而通常口岸或其他渠道截獲的大部分是幼蟲或卵，通常的做法是室內飼養獲得成蟲后，再進行形態鑒定。

形態鑒定具有快速、簡便和經濟等特點，但同時也有局限性。尤其在鑒別或區分實蠅類害蟲的近似種時，要求害蟲具備完整的形態結構，同時操作人員需具備豐富的鑒定實踐經驗和專業技能[14]。而形態分類上某些重要特征同時存在表型可塑性和基因可變性，形態上的同形種（種間的形態特征完全一致，但是基因差異顯著的幾個物種的總稱）通常不能通過常規的形態鑒定的來進行區別[15]。同時形態鑒定只能借助成蟲的形態特征，才能準確鑒定到種。實際上口岸截獲的實蠅多數為未成熟蟲態（卵、幼蟲或蛹），飼養到成蟲需要較長的時間，實蠅形態鑒定的周期一般情況下約需15～25天，檢測周期較長，因此傳統的成蟲形態鑒定并不利于口岸快速檢驗通關的實際需求。

3.2 聲波檢測

不同的聲波頻譜特征反映了各種蟲聲所特有的信息，20世紀80年代，中外部分學者曾開展過應用聲波檢測害蟲的研究。美國農業研究的科學家于1985年提出了一種新的檢測方法，通過組裝一系列的中間裝置，使揚聲器最終傳出果實內感染實蠅幼蟲取食與活動的聲音，輸入不同聲音信息，應用單片微機處理，貯存，識別，顯示與自動控制系統檢測，在幾秒鐘內即可檢測出來[16]。Litzcow[17]設計與發展了具有1個或幾個聽診器探頭的工具，通過探測昆蟲響聲而確定商品柑桔、堅果、谷粒是否受害蟲侵染。邱友德等[18]通過對芒果內桔小實蠅幼蟲為害聲波進行測試錄音，將這些錄音蟲聲進行頻譜分比較，從已得出的蜜柑大實蠅幼蟲為害聲2個樣本頻譜分析顯示出一定的模式。邱友德初步試驗表明，應用探測器可探測到芒果中海地西印度實蠅與德州墨西哥實蠅幼蟲的取食聲，并能準確地用來探測各種實蠅幼蟲在芒果中取食的顫動聲。

聲波檢測中關于器械靈敏度與抗外界噪聲干擾的矛盾問題，一直成為該技術發展的一個瓶頸。在靈敏度太高時，稍有聲音傳入，感應可很快顯示，各種干擾信號也同時輸入，從指示器上很難區別干擾信號與害蟲聲波之間的差異；而如果靈敏度太低，又不利于檢測目標物的信號[19]。幼蟲混合振動信號具有較大的隨機性和變異性，規律性不強，采用常規示波技術難以進行比較和得出定量的結論[20]。由于諸多因素，該技術后來一直沒有廣泛推廣應用。

3.3 分子檢測

害蟲的分子鑒定具有快速、準確、客觀和對樣品要求低等諸多特點，可對形態鑒定起補充作用。分子檢測鑒定實蠅類害蟲的方法很多，各有千秋[21]。從20世紀80年代開始，分子生物學的飛速發展使分子遺傳標記（molecular genetic marker）技術層出不窮。同時，PCR（DNA聚合酶鏈反應）技術的發展以及用于分析遺傳數據的相關計算機應用軟件和統計方法的開發應用，大大推動了分子遺傳標記技術在昆蟲分類學、遺傳學、系統學、生態學等多學科多領域的應用，同時也促進了害蟲分子鑒定的發展。

分子檢測周期短速度快，尤其不受靶標的形態、性狀、大小等方面的影響，如在昆蟲鑒定中不受蟲態、數量、個體間性狀差異及材料完整度的限制（如個體的殘缺）等因素的限制[21]，如Muraji等[23]從實蠅的腿節和很少的個體殘肢中提取DNA，成功地進行PCR擴增反應，通過基因序列分析，保存了實蠅材料的完整。

關于桔小實蠅分子的鑒定檢測，國內外學者也開展了許多研究。He等[24]曾對夏威夷和泰國兩國的桔小實蠅種群進行了鑒別研究，他們利用2個室內種群和3個野生種群，運用PCR擴增技術和EPIC技術，針對不同種群個體間肌動蛋白基因內含子序列進行了分析檢測，通過測序比對發現，3個等位基因在5個種群中存在頻率不同，他們用限制酶切技術對不同種群的非等位基因也進行了分析研究。Lu-KH等[21]利用RAPD技術從實蠅類害蟲中找出特異帶，并對特異帶進行篩選、純化、測序，然后根據序列設計特異引物來區分桔小實蠅、瓜實蠅和南瓜實蠅等幾類實蠅類害蟲。張亮等[25]篩選得出的5個引物對桔小實蠅及其幼蟲以及番石榴實蠅及其幼蟲的基因組DNA擴增結果基本一致，所建立的指紋圖譜可以作為6個種各蟲態的鑒定依據，試驗結果穩定、可靠，可對6種實蠅近緣種類進行鑒定區分。孔秋蓮等[26]利用特異性嵌套式PCR引物對桔小實蠅的rDNA基因片段進行擴增，通過進一步序列分析，確定該蟲與其近緣種的關系，并能確定樣本的種屬關系，該試驗建立的分子鑒定體系，可應用于口岸微量桔小實蠅卵快速、準確檢驗。張紅梅等[27]用RAPD技術對陜西省常見的4種實蠅進行了研究，試驗篩選出的5種RAPD引物S61、S107、S126、S275、S1142，可以對4種實蠅基因組DNA擴增出穩定清晰的多態性片段，其中RAPD引物S126可以把南瓜實蠅和具條實蠅、具條實蠅和三點棍腹實蠅分開，利用UPGMA法聚類后構建的發育系統樹與傳統分類結果完全一致。以上研究結果對開發桔小實蠅快速可靠的分子檢測新技術提供了很好的參考作用。

DNA條形碼技術（DNA barcoding）是通過對標準目的基因DNA序列的分析來進行物種鑒定的技術[28]。2003年，加拿大動物學家Hebert[29]首次將DNA條形碼概念引入了生物界。DNA條形碼，也稱DNA條形編碼，其類似于超市商品包裝上用于識別商品的粗細、間隔不同的黑白條紋圖案，是一段長度約為650 bp的線粒體基因片段，線粒體細胞色素C氧化酶亞基I （Cytochrome C oxidase I， COI）的前部。它普遍存在于所有的有氧生物，參與生物的有氧呼吸和能量生產過程，其進化速率適中，因此被廣泛應用于節肢動物包括大多數昆蟲的分類鑒定[30-31]。為了彌補昆蟲外部形態鑒定在檢驗檢疫中的不足，近年來，DNA條形碼技術成為快速鑒定檢疫性害蟲的重要手段之一，具有廣泛的應用前景。目前國內尚未見到桔小實蠅DNA條形碼鑒定的相關報道，然而這方面的研究目前已有許多科學家著手進行，相信不久將來就能取得很好的結果。

4 展望

當前，國內外經濟貿易快速發展，為適應時局，快速、準確確認檢疫對象的疫情并有效保護農作物生產任重道遠，如水果的進出口發展越來越快，進一步開展對桔小實蠅的檢測鑒定新技術研究對于快速通關等具有重要的意義。如何采用先進的分子技術手段研究桔小實蠅地理種群間的遺傳分化和種群親緣關系，掌握了解該蟲的生態適應規律及機制、擴散途徑及機制、可持續控制措施等，成為當前倍受關注的主要熱點問題，今后加快這些領域的研究對于可持續防控桔小實蠅也具有重要意義。

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