饑餓脅迫下大鱗副泥鰍外周紅細胞的形態變化

杜良 鐘愛華 周兵飛等

摘要[目的] 為研究饑餓脅迫下魚類的生理生化變化提供參考。[方法] 采用傳統瑞氏染色法研究饑餓脅迫下大鱗副泥鰍外周紅細胞的形態變化。[結果] 大鱗副泥鰍的成熟紅細胞逐漸發生變化，先出現核膜溶解，然后出現細胞形變，接著出現核質擴散和細胞膜溶解，最后整個成熟紅細胞膜完全溶解，核染色反應由紫黑色變為紫紅色最后變為粉紅色。大鱗副泥鰍的幼稚紅細胞則明顯增多。[結論] 在饑餓脅迫下大鱗副泥鰍外周紅細胞出現核異常，主要表現為核膜溶解和核質擴散，因此紅細胞核異常可以作為饑餓脅迫的指標。

關鍵詞饑餓脅迫；大鱗副泥鰍；紅細胞；形態

中圖分類號S912文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）23-07761-03

基金項目浙江海洋學院大學生科技創新項目（浙海院團〔2013〕38號）；浙江省教育廳科研項目（Y201328411）。

作者簡介杜良（1991-），男，山東濟寧人，本科生，專業：水產養殖。*通訊作者，講師，碩士，從事水生生物基礎生物學研究。

收稿日期20140707大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus），隸屬鯉形目（Cypriniformes）、鰍科（Cobitidae）、花鰍亞科（Cobitinae）、副泥鰍屬（Paramisgurnus），我國除青藏高原外，各地區的河川、溝渠、水田、池塘都有大鱗副泥鰍的分布。大鱗副泥鰍肉質細嫩，味道鮮美，是一種高蛋白、低脂肪類的高檔營養珍品，被人們稱為“水中人參”；大鱗副泥鰍還具有較高的藥用價值，對肺炎、皮膚搔癢、跌打損傷、手指疔瘡、小便不暢和乳腺癌等均有一定的療效，因此泥鰍是一種生產潛力大、很有發展前途的養殖品種，國內外市場的需求量較大[1]。

饑餓是魚類在自然水域生態系中所必須面對的一種生理脅迫現象，產生饑餓脅迫的原因有自然界中食物分布在空間上的不均勻性、季節更替或環境劇變等，即使在養殖條件下由于養殖密度過大、個體間相互競爭、投餌不足、投喂技術不當等原因導致魚類出現因食物短缺而引起的饑餓脅迫[2]。饑餓脅迫既是魚類中經常面臨的生理脅迫現象，也是影響魚類正常生長、發育和生存的重要環境因子之一，對魚類正常生長、發育和生存產生重要影響。研究表明，饑餓可以影響魚類代謝、行為、組織結構、存活、繁殖、肌體組成成分、酶活性和恢復生長[3-5]。在自然環境下，因季節更替大鱗副泥鰍在冬季出現自然停食而處于饑餓狀態。目前，饑餓脅迫下大鱗副泥鰍紅細胞形態的變化尚未見報道。筆者研究大鱗副泥鰍饑餓脅迫下紅細胞的形態變化，以期為饑餓脅迫下魚類的生理生化變化提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗魚試驗用魚是由浙江省舟山臺島鰍業有限公司提供的同批次大鱗副泥鰍，共82尾。試驗開始前，將試驗魚放入特定的養殖箱內，養殖箱為400 L HDPE水箱，對試驗魚暫養7 d，以使其適應試驗環境。

1.2試驗設計及養殖管理在獲得試驗用魚后，將試驗魚平均分到3個平行養殖箱內（水體體積250 L），試驗魚體長（10±2）cm，初始體重為（15±3）g，每日中午12：00準時投喂由浙江省舟山臺島鰍業有限公司提供的顆粒飼料，至魚恰好飽食，進行為期10 d的適應性暫養，以消除其應激性。

適應性暫養期間，室溫控制在22 ℃；光照條件為弱光環境，在白天試驗室內關閉窗簾，晚上打開窗簾；養殖用水為學校自來水系統提供的自來水，經過48 h的曝氣后注入養殖箱內，每48 h換水1次，每次換水125 L；因大鱗副泥鰍所需氧氣量不像其他魚類那么多且其喜靜不喜動，因此不放置充氧設備，以免試驗魚受驚死亡，只通過換水的方式來提供其生存所需的氧氣。

經過適應性暫養后，便開始饑餓試驗。饑餓試驗期間，溫度、光照和氧氣等條件維持不變，僅停止投喂；每日觀察2次（早12：00和晚19：00），每周二上午10：00進行采樣。饑餓時間為42 d。

1.3樣本采集使用斷尾椎取血法采集樣本。樣本采集時，從3個平行養殖箱中各取2條體表完整、行為正常的大鱗副泥鰍，解剖后剪斷尾椎，取血。

1.4血涂片制作取2片準備好的載玻片，將斷尾處的血液擠出1滴，滴落在載玻片的左端；血滴半徑一般為2 mm；取推片置于玻片的近中心側，使推片和玻片間成45°～80°角，血膜兩邊留出一定的空隙；將推片向左移動，與血滴相接觸；當血液沿推片的邊緣分散后，以稍用力而平穩的速度向右推。因為是全血涂片，第1次涂片時血膜較厚，因此進行第2次涂片，將推片上的殘血迅速擦干并在玻片上將血膜再次由左向右復推1次，此時血膜變得薄而均勻；將涂片置于試驗臺上自然風干。

1.5染色采用傳統的瑞氏染色法進行染色。使用瑞氏染色液（杭州天和微生物試劑有限公司出品）分別對8片血涂片進行染色，其中甲液（對氨基苯磺酸0.8 g溶解于100 ml 2.5 mol/L乙酸中）染色45 s，乙液（甲萘胺0.5 g溶解于100 L 2.5 mol/L乙酸溶液）染色7.5 min，然后流水沖洗并干燥。

1.6紅細胞形態觀察將染色后的涂片進行干燥并置于光鏡下觀察。隨機選取大鱗副泥鰍血涂片的視野，觀察紅細胞細胞質、細胞核的染色情況；記錄細胞膜、細胞質、細胞核及核膜的形態，將觀察到的結果進行備注并先使用Canon A3100彩色照相機進行拍照。同時，將染色效果好的涂片，置于奧林巴斯倒置顯微鏡下進行拍片。

2結果與分析

2.1成熟紅細胞的形態大鱗副泥鰍血涂片的有形成分中，紅細胞占絕大多數，紅細胞主要分為成熟紅細胞和幼稚紅細胞。大鱗副泥鰍成熟的紅細胞形態呈橢圓形或長橢圓形，表面光滑。細胞質不能被染色或出現極淡的藍色。核呈小橢圓形，核小而致密，位于細胞中央，染色反應為紫紅色或紫黑色。

大鱗副泥鰍成熟的紅細胞形態2.2幼稚紅細胞的形態 泥鰍幼稚紅細胞形態不規則，多呈圓形或橢圓形，表面不光滑，部分有不規則突起。細胞質不能被染色或出現極淡的藍色。核圓形，位于細胞中央或稍偏向一側，染色反應為紫紅色或紫黑色（）。

大鱗副泥鰍幼稚紅細胞的形態2.3饑餓過程中紅細胞的形態變化饑餓至第7天，可觀察到大量成熟的紅細胞，細胞規則，界限清晰；還能觀察到少量的幼稚紅細胞，圓形，染色反應為紫黑色，直徑略小于成熟紅細胞的長徑。同時，觀察到少量的成熟紅細胞細胞核開始出現模糊現象，染色反應呈淡紫紅色。

饑餓第7天大鱗副泥鰍的紅細胞形態饑餓至第14天，依然可以觀察到大量的成熟紅細胞以及少量的幼稚紅細胞。但是，核膜溶解現象開始增多，部分紅細胞的細胞核開始擴散，溶解擴散的核染色反應為紫紅色（A），出現極少量完全溶解的細胞。同時，部分成熟紅細胞已經發生形變，不再維持橢圓形或長橢圓形，呈現雨滴狀或豌豆狀（B）。

注：A.核膜溶解；B.細胞形變。

饑餓第14天大鱗副泥鰍的紅細胞形態饑餓至第21天，依然能夠觀察到大量成熟紅細胞及少量幼稚紅細胞。但是，出現核膜溶解現象的成熟紅細胞開始大量出現，且部分成熟紅細胞核膜已經完全溶解，核質已經擴散，細胞體積增大，核呈現不規則形狀，染色反應為淺紫色或粉紅色。細胞形變進一步加劇，細胞膜溶解增加。

饑餓第21天大鱗副泥鰍的紅細胞形態饑餓至第28天，成熟紅細胞數量明顯減少，圓形幼稚紅細胞數量開始增多（A）。核膜完全溶解，核質擴散的成熟紅細胞急劇增多，細胞已不能維持正常形狀，并且能明顯觀測到完全溶解的成熟紅細胞的核質，染色反應為淺紫色或粉紅色（A）。另一方面，發生形變的細胞也急劇增多，多呈現雨滴狀，少數呈豌豆狀，且大部分發生形變的細胞細胞膜開始溶解（B）。

饑餓至第35天，成熟紅細胞已急劇減少，且大部分都已發生形變，與此同時幼稚紅細胞含量出現明顯上升。完全溶解的成熟紅細胞數量也明顯增加，染色反應為粉紅色。

饑餓至第42天，成熟的紅細胞含量進一步減少，只能觀測到少量未發生形變的細胞，同時能觀察到明顯增多的幼稚紅細胞。完全溶解的成熟紅細胞大量出現，染色反應為粉紅色。

通過觀察發現，大鱗副泥鰍成熟紅細胞含量隨著饑餓時間的延長而不斷下降，泥鰍的幼稚紅細胞相對數量明顯增多；形態上，泥鰍的成熟紅細胞形態變化表現為：先出現核膜溶解，然后出現細胞變形，接著出現核質擴散和細胞膜溶解，最后整個成熟紅細胞膜完全溶解，核染色反應由紫黑色變為紫紅色最后變為粉紅色。

注：A.細胞膜完全溶解和核擴散；B.細胞膜溶解。

饑餓第28天大鱗副泥鰍的紅細胞形態饑餓第35天大鱗副泥鰍的紅細胞形態饑餓第42天大鱗副泥鰍的紅細胞形態3 討論

在魚類中，除短腹冰魚等極少數南極目魚類沒有紅細胞或紅細胞含量很少外，絕大多數魚類的紅細胞含量均占其血細胞總量的90%以上[6]；該細胞呈橢圓形或長橄欖形，表面光滑，成熟紅細胞中央有1個圓形或橢圓形細胞核，與哺乳類的無核成熟紅血細胞顯著不同[6-7]。在大鱗副泥鰍外周血中能觀察到大量成熟紅細胞，正常生理狀態下其外形呈橢圓形，表面光滑，中央有1個圓形或橢圓形細胞核。然而，隨著饑餓時間的延長，其成熟紅細胞的形態發生了顯著變化，首先出現核膜溶解和細胞變形現象，然后核膜完全溶解核質擴散和細胞膜溶解，最后細胞膜完全溶解，僅剩下擴散的核質，稱為核影[7]，染色反應呈粉紅色。脾臟是魚類造血、過濾血液和破壞衰老紅細胞的中心場所。隨著饑餓時間的延長，大鱗副泥鰍外周血中出現大量的紅細胞核影，可能是因為饑餓不僅影響了紅細胞的形態，還影響了大鱗副泥鰍的脾臟功能，使其過濾血液和破壞衰老紅細胞的功能下降，導致大量被破壞的紅細胞無法自然清除。

魚類紅細胞與哺乳動物的紅細胞一樣，其主要機能為運輸O2和CO2，同時緩沖機體產生的酸堿物質以及維護體內離子平衡等。隨著饑餓時間的延長，大量成熟紅細胞遭到破壞，為了維持運輸氧氣和二氧化碳等生理功能，大鱗副泥鰍外周血中幼稚紅細胞的數量不斷增加。魚類造血器官除了脾臟外，還有腎臟等器官參與造血。在饑餓脅迫下，真正參與造血的器官還需進一步研究。

42卷23期杜 良等饑餓脅迫下大鱗副泥鰍外周紅細胞的形態變化由于某些因素造成紅細胞膜破裂和胞質外溢，而其核仍能在血液中存在一段時間，這種主要是核質的紅細胞被稱為“核影”紅細胞，由成熟紅細胞到“核影”紅細胞的過渡類型為分解紅細胞，“核影”紅細胞是紅細胞衰老過程中的形態表現，主要與魚體自身的生理狀態有關[8]。筆者發現在饑餓脅迫下隨著饑餓時間的延長，能觀察到成熟紅細胞、分解紅細胞和“核影”紅細胞。1982年，Hooftman[9]等首次證實化學誘變劑甲醛磺酸乙酯（EMS）能誘發泥蔭魚外周紅細胞微核形成及核異常。筆者也發現在饑餓脅迫下大鱗副泥鰍外周紅細胞出現核異常，主要表現為核膜溶解，核質擴散，因此紅細胞核異常可以作為饑餓脅迫的指標。

參考文獻

[1] 朱興國，葉永興，趙后會，等.泥鰍無公害高產高效養殖新技術[J].內陸水產，2007（1）：38.

[2] KIM M K，LOVELL R T.Effect of restricted feeding regimens on compensatory weight gain and tissue changes in channel catfish Ictalurus punctatus in ponds[J].Aquaculture，1995，135（4）： 285-293.

[3] LVAREZ A，GARCA B，GARRIDO M D，et al.The influence of starvation time prior to slaughter on the quality of commercial-sized gilthead seabream （Sparus aurata） during ice storage[J].Aquaculture，2008，284（1/4）：106-114.