正交試驗設計優化超聲煎煮法提取丹參中丹參素的研究

楊炳火 夏崇才 周芙瓊 胡新

丹參是唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖［1］，是臨床心血管疾病最常用中藥之一。具有活血祛瘀，調經止痛，清心除煩的功效［2-3］。丹參素是丹參水溶性成分中的主要活性成分，現代藥理研究表明，丹參素具有心肌保護、神經細胞保護、抗氧化、抗炎和增強免疫力、抗腫瘤、改善微循環等作用［4-5］。超聲技術提取中藥具有提取效率高、省工、省時等優點［6］，本文將超聲與煎煮相結合對丹參素進行提取，并采用正交實驗法篩選最佳提取工藝，同時與煎煮法比較，考察提取效果。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1290 Ⅰnfinity 超高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);Agilent VWD 型檢測器(美國安捷倫公司);KQ-300DE 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);FA1104 電子分析天平(上海良平儀器儀表有限公司);1612-1 離心機(上海醫療器械有限公司)。

1.2 試藥

丹參藥材(安徽滬春堂中藥飲片有限公司);丹參素鈉對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號111366-201305);甲醇為色譜純，水為重蒸水，其它試劑為分析純。

1.3 丹參藥材提取方法

煎煮提取法［7］:取丹參藥材約50 g，精密稱定，加水500 ml 煎煮，提取3 次，每次40 分鐘，合并提取液濃縮至200 ml，作為煎煮法供試品溶液。

超聲煎煮提取法:取丹參藥材約50 g，精密稱定，加入500 ml 水，分別先進行超聲處理10、20、30分鐘，超聲功率300 W，頻率40 KHz，然后采用煎煮方式，在煎煮20、40、60 分鐘以及煎煮次數1、2、3 次的不同情況下進行提取，所得提取液濃縮至200 ml，離心，過濾，續濾液作為超聲煎煮法供試品溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18 柱(4.6 ×250 mm);流動相:甲醇—0.5%醋酸水溶液=5∶95;流速1 ml/min;檢測波長281 nm;柱溫30 ℃;進樣量10 μl。

1.5 對照品溶液的制備

精密稱取丹參素鈉2.0 mg，置10 ml 容量瓶中，加入50%甲醇，定容，得0.20 mg/ml 丹參素鈉對照品溶液。

1.6 統計方法

采用Excel 軟件進行線性回歸、正交實驗設計的統計分析。

2 結果

2.1 線性關系考察

精密吸取丹參素鈉對照品溶液2、4、8、12、16 μl注入超高效液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積的積分值(Y)對對照品的進樣量(X)制備標準曲線方程，得到標準曲線方程為Y =175.27X-22.942，r =1.0000。結果表明，丹參素鈉在0.40 ～3.2 μg 范圍內線性關系良好。

2.2 精密度試驗

精密吸取0.20 mg/ml 丹參素鈉對照品溶液10 μl 注入超高效液相色譜儀，連續進樣6 次，結果顯示，丹參素峰面積RSD 為1.28%，表明精密度良好。

2.3 重復性試驗

精密稱取同一樣品6 份，按1.3 項下“煎煮提取法”制備供試品溶液，并按上述色譜條件對丹參素含量進行測定，其RSD 為0.99%，表明重復性良好。

2.4 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 小時進樣，測得丹參素含量的RSD 為1.05%，表明供試品溶液在12 小時內穩定。

2.5 加樣回收率試驗

取已知含量的供試品6 份，精密稱定，分別精密加入一定量的對照品，按1.3 項下“煎煮提取法”處理，并按上述色譜條件對丹參素含量進行測定，計算回收率，其平均值為98.12%，RSD 為3.08%。結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.6 超聲煎煮提取工藝最佳提取條件的考察

以丹參素提取率為考察指標，選擇影響丹參素提取的主要因素超聲時間(A)、煎煮時間(B)、煎煮次數(C)為考察因素，按L9(34)正交實驗設計進行試驗，因素水平表見表2，正交實驗結果見表3，方差分析見表4。

表2 正交實驗因素水平

表3 L9(34)正交實驗結果

表4 方差分析

由方差分析結果顯示，A，C 有顯著性差異(P ＜0.05)，極差RC＞RA各因素對丹參素總量的影響依次為:C＞A＞B;同一因素的3 個水平比較得知:A3＞A1＞A2，B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1。考慮到節能經濟因素，故確定最優組合為A3B1C3，即超聲10 分鐘，煎煮20 分鐘，煎煮3 次。

2.7 樣品測定

取3 份樣品各50 g，按2.5 項下所得超聲煎煮最佳工藝提取丹參素，計算其總量，并與煎煮法供試品溶液中丹參素總量比較，結果見表5。

表5 樣品含量測定結果(n=3)

3 討論

流動相的選擇方面，實驗中作者曾考察了甲醇—水系統、乙腈—水系統和甲醇—醋酸水溶液系統作為丹參素含量測定的流動相，結果發現當以甲醇—水和乙腈—水做流動相時，各色譜峰拖尾嚴重，且各峰之間分離效果較差，而以甲醇—醋酸水溶液系統做流動相后，各色譜峰峰形良好且能得到良好的區分。為了改善峰形、提高分離度，調整流動相比例，最后確定使用甲醇—0.5%醋酸水溶液(5:95)作為本實驗的流動相，所得丹參素峰形較好，分離度大于1.5，理論塔板數大于1500。

提取溶劑的選擇方面，參照《中華人民共和國藥典》(一部)(2010年版)及相關文獻［7-8］中丹參素的提取方法，分別考察了30%甲醇、50%甲醇、100%甲醇等溶劑對丹參素進行提取。結果表明，用50%甲醇的提取效果較好，故本試驗采用50%甲醇為提取溶劑。

樣品測定結果顯示，采用超聲煎煮法所得丹參素的量明顯多于傳統煎煮法。主要原因是超聲波能產生強烈振動、高加速度、強烈的空化效應和攪拌作用，可加速有效成分進入溶劑，從而有利于丹參素的提取。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［S］.北京:中國中醫藥出版社，2010:70.

［2］羅彩蓮.丹參的藥理作用與臨床應用［J］.中國當代醫藥，2012，19(12):11-12.

［3］畢躍峰，賈陸，張小娟，等.同提取方法對丹參中丹參酮ⅡA 和丹酚酸B 含量測定的影響［J］.藥物分析雜志，2009，29(7):1209-1212.

［4］樊永慶，楊濟昆，劉建平，等.丹參素緩釋微丸的制備及家兔體內藥動學研究［J］.藥學與臨床研究，2013，21(2):105-108.

［5］岳喜典，王麗，曲桂武，等.非水滴定法測定丹參素鈉原料藥的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19(15):137-139.

［6］徐飛，尹蓉莉，鐘玲，等.超聲提取六味地黃丸復方的工藝研究［J］.時珍國醫國藥，2006，17(8):1432-1434.

［7］路毅.丹參水煎煮工藝及最佳粒徑研究［D］.武漢:華中科技大學，2007.

［8］魏惠珍，王躍生，吳有根，等.HPLC 同時測定冠心丹參膠囊中丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 的含量［J］.中成藥，2009，31(1):64-68.

［9］張筱芳，王莉.HPLC 法測定養心活血片中丹參素的含量［J］.西北藥學雜志，2012，27(5):409-411.